《International Journal of Molecular Sciences》：Exploring the Toxicological Impacts of DOTP Exposure on Pulmonary Arterial Hypertension via Network Toxicology, Virtual Knockout, Molecular Docking and Experimental Validation
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中文摘要翻译：
环境因素是肺动脉高压（PAH）发病的重要诱因。对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DOTP）是一种广泛用于日常生活的增塑剂，具有潜在的健康危害。然而，长期DOTP暴露后PAH发生的分子机制仍知之甚少。本研究旨在通过整合网络毒理学、虚拟敲除、分子对接
中文摘要翻译：
环境因素是肺动脉高压（PAH）发病的重要诱因。对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DOTP）是一种广泛用于日常生活的增塑剂，具有潜在的健康危害。然而，长期DOTP暴露后PAH发生的分子机制仍知之甚少。本研究旨在通过整合网络毒理学、虚拟敲除、分子对接及实验验证方法，探讨DOTP暴露与PAH之间的分子机制。研究人员筛选出DOTP的四个核心靶点（AKT1、EGFR、KDR、SRC），并进行了scTenifoldKnk虚拟敲除分析。功能富集结果表明，AKT1、EGFR和KDR显著扰动了与肺动脉内皮细胞（PAEC）损伤和迁移调控相关的通路。随后，研究人员采用CCK8、LDH释放、RT–qPCR和transwell实验证实，DOTP暴露可促进PAEC损伤和迁移，并伴随AKT1、EGFR和KDR表达上调。最后，通过分子对接和分子动力学模拟阐明了DOTP与靶蛋白之间的相互作用及构象变化。本研究揭示了DOTP诱导PAH发生发展的分子机制，为探讨环境污染物对PAEC功能障碍及PAH发病机制的影响提供了新的理论框架。
论文解读文章
一、研究背景与问题
肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension, PAH）是一种复杂且进行性的肺血管疾病，以肺血管阻力升高和肺血管重构为特征，最终可导致右心室肥厚甚至死亡。其病理生理机制涉及多种因素，包括遗传和先天因素、基础心血管和肺部疾病、药物、毒素以及环境暴露等。这些因素可导致肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）、肺动脉内皮细胞（PAECs）、成纤维细胞和巨噬细胞等多种细胞类型的功能障碍。其中，PAECs是致病因素的直接靶点，可导致细胞损伤、氧化应激、炎症浸润和过度增殖。尽管医学研究的进步已开发出多种有效的治疗方法，显著改善了患者预后，但PAH的死亡率仍然相对较高。因此，深入探究PAH的病因学因素对于改善患者生活质量至关重要。
对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（di-(2-ethylhexyl) terephthalate, DOTP）作为一种主要增塑剂，近几十年来已广泛存在于日常生活的各个方面，包括汽车内饰、家居装饰、食品包装甚至医疗器械中。由于这些产品与人体直接接触，如此大规模的应用可能带来潜在的健康风险。已有研究表明，DOTP暴露可通过影响细胞增殖、基因转录调控、肿瘤微环境及PI3K-Akt-mTOR通路促进乳腺癌进展；DOTP通过靶向EGFR、BCL2、NFKB1、CASP3、ERBB2和mTOR发挥毒性作用，进而诱导慢性自发性荨麻疹；DOTP还可通过促进氧化应激、炎症和凋亡激活诱导神经毒性；过敏性呼吸道疾病也可通过免疫相关和多靶点机制由DOTP触发。然而，关于DOTP与PAH之间关联的研究尚属空白。值得注意的是，其结构异构体邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）已被证实具有潜在致癌性，并通过破坏维持血管稳态的关键生物学过程促进PAH发病。鉴于两者结构相似性，研究人员假设DOTP可能具有类似的毒性作用，并可能是PAH的潜在危险因素。因此，评估DOTP与PAH之间的关系并探索其潜在毒理学机制至关重要。
网络毒理学是一个基于生物分子网络的新兴领域。通过整合多组学数据和计算模型，可以构建连接化合物、靶点、通路和毒性结局的交互网络，从而揭示毒物促进疾病发展的机制。将基于网络的靶点预测、分子对接和实验验证相结合的综合策略已成功应用于阐明多种生物活性物质和环境毒物的作用机制。此外，虚拟敲除、分子对接和分子动力学模拟策略的运用为全面解读该疾病的毒理学特征和推进对其进展的理解奠定了基础。网络毒理学已应用于多种疾病研究，但将其应用于PAH研究的报道甚少，凸显了深入探讨毒物在PAH发病中作用的迫切需求。
二、研究内容与结论
本研究采用网络毒理学、虚拟敲除和分子对接技术，结合体外实验验证，全面探讨了DOTP与PAH之间的关联及潜在机制。研究结果揭示了DOTP诱导PAH的分子机制，为理解环境污染物导致PAEC损伤的机制提供了新的理论范式，并为制定与化学暴露相关的PAH预防策略和靶向治疗奠定了基础。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
三、主要关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用PubChem数据库获取DOTP分子结构信息，通过Swiss Target Prediction、Superpred和PharmMapper三个数据库预测DOTP潜在靶点；从GeneCards、OMIM和GAD数据库检索PAH相关靶点；使用STRING数据库和Cytoscape_v3.7.1构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并利用MCODE、CytoNCA和CytoHubba MCC算法鉴定核心靶点；采用Hiplot生物医学AI平台进行GO和KEGG富集分析；利用GEO数据库下载GSE210248单细胞测序数据集（包含3例正常供体和7例PAH患者样本，共22,704个细胞和19,582个基因），使用Seurat包进行质量控制与预处理，采用scTenifoldKnk包（v1.0.3）进行虚拟敲除分析；使用AutoDockTools进行分子对接，使用GROMACS 2022.2进行分子动力学模拟；通过CCK8、LDH释放、RT-qPCR、Transwell迁移实验和Western blot等体外实验进行验证。
四、研究结果
2.1 DOTP潜在靶蛋白的鉴定：从PubChem数据库获取DOTP分子结构信息，通过Swiss Target Prediction、Superpred和PharmMapper三个数据库预测DOTP相关靶点，去重后共获得446个潜在靶点。
2.2 PAH相关差异表达基因的鉴定与共表达网络构建：从GeneCards、GAD和OMIM数据库检索PAH相关靶点，通过维恩图鉴定出113个DOTP与PAH重叠靶点。利用STRING数据库和Cytoscape_v3.7.1构建PPI网络，通过MCODE、CytoNCA和CytoHubba MCC算法鉴定出六个核心靶点：AKT1、CASP3、EGFR、ESR1、KDR和SRC。
2.3 靶点功能分析与通路富集分析：对112个靶点进行功能富集分析，KEGG通路富集分析显示三条与PAH病理过程显著相关的通路，即化学致癌-活性氧通路、HIF-1信号通路和MAPK信号通路。AKT、EGFR、SRC和KDR被确定为三条通路与六个核心靶点共有的蛋白，表明DOTP可能通过这四个核心靶点对PAH发挥作用。
2.4 PAH单细胞RNA测序图谱：对GSE210248单细胞测序数据集进行详细分析，质控后保留22,704个高质量细胞和19,582个基因。通过Harmony批次校正消除不同样本间的批次效应。UMAP降维显示健康供体和PAH患者细胞间存在明显的转录组聚类差异。单细胞聚类注释鉴定出14种不同的细胞类型，包括B细胞和浆细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、内皮细胞（静脉）、内皮细胞（动脉）、上皮细胞（AT2）、上皮细胞（分泌型）、成纤维细胞和肥大细胞。
2.5 scTenifoldKnk虚拟敲除提示核心靶点在PAEC迁移调控中的作用：对AKT1、EGFR、KDR和SRC进行虚拟基因敲除扰动。SOX18、ADGRL4、ADGRF5、TIMP3、PDGFB、PI16和SLC9A3R2是AKT1、EGFR和KDR敲除中最常被扰动的基因。SRC的分析未产生显著结果。GO和KEGG富集分析显示，AKT1、EGFR和KDR的成功敲除显著富集于与PAEC黏着斑和迁移调控相关的条目。
2.6 DOTP暴露促进PAEC损伤和迁移，并上调AKT1、EGFR和KDR蛋白水平：CCK8实验显示细胞活力随DOTP浓度增加而降低，选择200 μM DOTP进行后续实验。LDH释放实验表明DOTP促进LDH释放。DOTP刺激后TNF-α和IL-1β水平升高，表明DOTP可促进细胞炎症损伤。Western blot实验显示DOTP上调ET-1表达并下调eNOS表达，表明DOTP诱导内皮细胞特异性损伤。Transwell实验显示DOTP增强PAEC迁移能力。Western blot和免疫荧光实验证实DOTP处理后PAECs中AKT1、EGFR和KDR表达升高。
2.7 DOTP与核心靶点的分子对接：分子对接结果显示DOTP可与AKT1、EGFR和KDR稳定结合，结合能分别为?5.5 kcal/mol、?5.8 kcal/mol和?7 kcal/mol。结构分析显示DOTP通过氢键、Pi-sigma、Pi-Pi T型、烷基和范德华力等相互作用与靶蛋白结合。
2.8 DOTP与核心靶点的分子动力学模拟：RMSD分析显示所有DOTP-蛋白复合物随模拟进行逐渐趋于稳定。Rg值在DOTP结合后降低并趋于稳定，表明相互作用导致更紧凑的构象。FEL分析显示三个复合物均呈现单一低能态，表明整体结构相对稳定。RMSF分析显示DOTP周围氨基酸的柔性相对较低。SASA分析显示复合物SASA值稳定。氢键形成动力学分析证实DOTP与AKT1、EGFR和KDR之间形成了氢键。
五、讨论与结论
讨论部分指出，DOTP作为一种环保增塑剂已完全替代传统有毒增塑剂，但近年研究越来越清楚地表明，长期暴露于DOTP也可通过干扰多种细胞信号通路产生不良影响。本研究揭示DOTP可能通过调控活性氧通路、HIF-1信号通路和MAPK信号通路在PAH病理过程中发挥重要作用。AKT1是血管重构和PAH的关键调控因子，参与细胞增殖和迁移等重要细胞过程，DOTP与AKT1的良好结合亲和力可能激活HIF-1和MAPK信号通路，促进PAEC损伤和迁移。EGFR家族成员是调控PAH中细胞增殖和迁移的重要信号分子，DOTP刺激下EGFR的异常激活破坏肺血管内皮稳定性，最终促进血管重构和PAH进展。KDR（即VEGFR2）是PAH中血管生成的关键调控受体酪氨酸激酶，DOTP介导的PAECs中KDR上调可能触发下游信号级联反应，导致内皮功能障碍和PAH中的病理性血管生成。
研究结论部分可翻译为：总之，这些发现不仅拓展了研究人员对长期DOTP暴露潜在毒理学后果的理解，也为认识导致PAH的环境危险因素提供了新的见解。
