膜破坏与电荷中和驱动LL37衍生肽与多黏菌素类抗大肠杆菌的协同作用

《Biomolecules》：Membrane Disruption and Charge Neutralization Drive Synergy Between LL37-Derived Peptides and Polymyxins Against E. coli

　　

背景/目的：抗菌肽（AMPs）为对抗耐药细菌（如大肠杆菌（E. coli））提供了有前景的策略。本研究评估了人源AMP LL37及其片段FK16和FK13与多黏菌素B、黏菌素和万古霉素联用对三种大肠杆菌菌株的体外协同作用。方法：由于大肠杆菌的外膜是抗菌剂的屏障，研究人员评估了这些AMP的膜通透化活性。研究人员进一步通过zeta电位测量检查了阳离子AMP与细菌表面之间的静电相互作用。为模拟生理条件，研究人员研究了血液中常见的Mg²⁺和Ca²⁺离子如何稳定细菌外膜并影响AMP活性。此外，研究人员评估了细胞质膜通透化作为抗菌作用的关键机制。最后，为支持临床转化，研究人员评估了AMP对人皮肤成纤维细胞的细胞毒性。结果：棋盘法测定显示，肽-抗生素组合在MHB培养基和阳离子调节MHB培养基中对所测试的大肠杆菌菌株均产生协同作用，FICI值范围分别为0.3125至0.5和<0.375至0.5。所有三种AMP（LL37、FK16和FK13）均表现出强大的外膜通透化活性。Zeta电位测量揭示了膜破坏与表面电荷中和之间的相关性。发现Mg²⁺和Ca²⁺离子的存在可稳定细菌外膜。细胞质膜通透化被确认为关键抗菌机制。细胞毒性测定证实了这些AMP对人体细胞的安全性。结论：该研究表明，LL37及其片段通过膜破坏和电荷中和增强常规抗生素对大肠杆菌的活性，FICI值（0.3125–0.5）、膜破坏和电荷中和证明了这一点。虽然生理条件下的二价阳离子影响AMP功效，但这些肽显示出针对大肠杆菌的临床应用潜力。

**论文解读：LL37衍生肽与多黏菌素协同抗大肠杆菌的机制研究**

**1. 研究背景与问题**

抗菌药物耐药性（AMR）已成为全球重大公共卫生危机，每年约导致70万人死亡，预计到2050年将升至1000万。世界卫生组织（WHO）于2017年发布了急需新型抗菌策略的12种细菌家族清单，其中大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）是社区和医院环境中最为普遍的革兰氏阴性病原体，引起全球最高数量的感染（包括尿路感染、败血症等）。大肠杆菌的外膜作为关键屏障，通过带负电荷的脂多糖（LPS）与二价阳离子（如Mg²⁺和Ca²⁺）形成稳定盐桥，降低膜通透性，阻碍抗生素进入胞内靶点。联合用药是临床治疗耐药革兰氏阴性菌感染的常用策略，但现有组合（如ceftolozane–tazobactam、ceftazidime–avibactam）可能加速耐药出现。2023年美国疾控中心报告了同时对Zerbaxa和Zavicefta耐药的VIM-GES-CRPA菌株暴发，凸显了开发新型协同策略的紧迫性。

人源抗菌肽LL37是固有免疫的关键效应分子，具有两亲性α-螺旋结构，但存在合成成本高和细胞毒性等问题。为克服这些局限，研究者开发了截短衍生物FK16和FK13，它们保留了抗菌活性，同时降低合成成本、扩大抗菌谱并降低对哺乳动物细胞的毒性。本研究旨在探索LL37及其片段与万古霉素、黏菌素（多黏菌素E）和多黏菌素B联用对三株临床大肠杆菌分离株的协同效应，并阐明其潜在机制，特别是膜破坏与电荷中和的作用。

**2. 主要技术方法**

研究采用棋盘微量稀释法测定联合用药的协同效应（以FICI≤0.5判定协同），并测定最低抑菌浓度（MIC）。通过zeta电位测量评估抗菌剂与细菌表面及游离LPS的静电相互作用。利用NPN荧光探针评估外膜通透化，利用碘化丙啶（PI）评估细胞质膜通透化。通过AMP预处理后万古霉素MIC的变化评价致敏作用。此外，在人皮肤成纤维细胞（HDF，ATCC CRL-2565）上评估细胞毒性。三株临床尿路致病性大肠杆菌（UPEC）B37、B73和B78来自美国明尼阿波利斯VA医疗中心的James Johnson博士。

**3. 研究结果**

**3.1 AMP与抗生素单独抗菌效果**

多黏菌素B和黏菌素对三株大肠杆菌具有最低MIC，而万古霉素因外膜屏障MIC最高。在三种AMP中，FK16抗菌活性最佳，这与其更有序的α-螺旋结构及含有N30、L31、V32残基有关。在含Mg²⁺和Ca²⁺的阳离子调节MHB（CMHB）培养基中，所有抗菌剂MIC普遍升高（除黏菌素对B73不变），显示二价阳离子对外膜的稳定作用，AMP的MIC升高4–16倍。外源LPS存在下，AMP的MIC显著增加，LL37和FK13的MIC分别升至>256 μg/mL和128 μg/mL，FK16虽增加4–8倍但仍是活性最强。

**3.2 AMP-抗生素联合效应**

在MHB培养基中，AMP与膜靶向抗生素（多黏菌素B和黏菌素）联合比与万古霉素联合更频繁地表现出协同作用。在CMHB中，AMP-多黏菌素B组合仍对三株菌均呈协同，AMP-黏菌素组合对B78和B37协同，而AMP-万古霉素组合仅在B37中显示出两例协同。

**3.3 电荷中和过程**

三株大肠杆菌的zeta电位为?35.4至?40.2 mV。LL37（净电荷+6）以最低浓度中和表面电荷，多黏菌素B（+5）次之，FK16和FK13（+4）相似。万古霉素（+0.83）需要更高浓度，而净电荷为零的氨苄西林无法中和。游离LPS实验证实三种AMP均能与LPS结合，LL37中和作用最强。Mg²⁺和Ca²⁺的存在使细菌和LPS的zeta电位升高，与盐桥形成一致。

**3.4 外膜通透化作用**

所有阳离子抗菌剂均增加外膜通透性，LL37作用最强，多黏菌素B次之，FK16和FK13相近，万古霉素弱，氨苄西林无作用。二价阳离子存在时，抗菌剂的外膜通透化活性整体降低，LL37降低最明显，多黏菌素B仍最有效。

**3.5 万古霉素致敏作用**

LL37预处理使B78和B37的万古霉素MIC降低24–32倍，FK16和FK13也有显著降低，表明外膜通透化可抑制大肠杆菌对万古霉素的内在耐药，促使万古霉素到达lipid II靶点。

**3.6 细胞质膜通透化作用**

FK16表现出最强的细胞质膜通透化能力，与其最低MIC一致。LL37和FK13活性相似，与二者抗菌效果相当。万古霉素活性有限，与其外膜渗透性差相符。

**3.7 细胞毒性**

LL37和FK16在高浓度（256 μg/mL）下导致HDF几乎完全死亡，而FK13的细胞毒性显著较低，提示其更好的生物相容性和临床潜力。这与FK13缺少N30、L31、V32疏水残基相关。

**4. 讨论与结论**

讨论部分指出，AMP与多黏菌素的协同优于与万古霉素的协同，尤其在生理相关条件下，且有望降低多黏菌素剂量以减少肾毒性和神经毒性。LPS结合与电中和在AMP免疫调节（如内毒素中和）中具有潜在意义，但游离LPS可隔离AMP。电荷中和程度与膜通透化在无二价阳离子时高度相关。万古霉素致敏实验证实外膜作为通透屏障的作用。Mg²⁺和Ca²⁺通过稳定外膜降低AMP功效，多黏菌素B因更长的脂肪酰链疏水插入作用受影响最小。研究强调细胞质膜通透化而非单纯外膜通透化是抗菌活性的关键预测因子。

结论部分强调：本研究突出了多黏菌素B和黏菌素与AMP（尤其是LL37及其片段）联用对抗耐药大肠杆菌的潜力，这些组合在生理相关条件下表现出强协同作用；外膜通透化与抗菌剂电荷紧密相关，二价阳离子通过干扰该过程稳定膜；细胞质膜通透化是AMP功效的关键决定因素。这些发现支持继续探索AMP-抗生素联合策略，并指导优化AMP设计以提高效力、选择性和临床适用性。该研究发表于《Biomolecules》。