多肽与多肽模拟物（polypeptoid）同核酸的络合：手性是否影响盐稳定性与形貌

《Biomolecules》：Complexation of Polypeptides and Polypeptoids with Nucleic Acids: Does Chirality Matter for Salt Stability and Morphology?

　　

液液相分离（LLPS），尤其是通过复凝聚（coacervation）实现的形式，提供了一种新颖的药物递送策略：将治疗性物质包裹于相分离液滴中，从而改善稳定性、溶解性与控释性能。多肽（polypeptide）与多肽模拟物（polypeptoid）因结构可调、适用性强，是该类体系的理想生物材料；其中多肽模拟物具有更强酶抗性与更可控的分子间作用，尤其适合络合研究。研究人员探究了L-型、D,L-型以及N-取代（peptoid）聚赖氨酸与核酸的二元络合，核酸包括两种长度的鲑鱼精子双链DNA（dsDNA）与面包酵母转运RNA（tRNA），核苷酸包括三磷酸腺苷（ATP）与三磷酸胞苷（CTP）。通过调节电荷分数，研究人员考察了复合物形貌，并测试不同离子条件下的盐耐受性。结果表明，dsDNA与聚赖氨酸/多肽模拟物形成沉淀，tRNA形成复凝聚液滴，原因可能在于二级结构差异；两种核苷酸在所有体系中均形成复凝聚物。L-同手性聚赖氨酸复合物盐稳定性最高，其次为外消旋聚赖氨酸，N-取代聚合物随离子强度升高最不稳定。所有dsDNA与tRNA体系在生理相关盐浓度下均保持络合。上述结果凸显了盐与聚合物结构对络合的调控作用，并为核酸封装与稳定化提供依据。

研究背景方面，细胞内液液相分离（LLPS）可把蛋白质与RNA组织成无膜动态区室；复凝聚（coacervation）作为LLPS子集，由聚电解质间静电作用驱动，可形成包裹治疗物的液滴，改善核酸类药物的溶解度、稳定性与释放行为。现有研究多关注多肽—多肽体系中的手性与盐效应，但核酸作为聚阴离子具有骨架几何、碱基堆积和二级/三级折叠等额外变量，因此研究人员希望明确核酸结构如何改变不同骨架化学体系中的盐耐受性与相行为，并回答标准氨基酸来源肽类与核酸络合是否必须依赖手性中心。

研究人员构建了聚赖氨酸变体体系：聚L-赖氨酸（PLK₅₀）、聚D,L-赖氨酸（PRK₅₀）与聚N-4-铵基丁基甘氨酸（PNK₅₀），分别与鲑鱼精子双链DNA（dsDNA-2000、dsDNA-350）、面包酵母tRNA、核苷酸ATP和CTP形成二元体系。研究发现，dsDNA因刚性双螺旋与高电荷密度倾向沉淀，tRNA因三叶草结构形成复凝聚液滴，ATP与CTP因缺乏高级结构也形成液滴。盐稳定性上，L-同手性体系最高，外消旋次之，N-取代多肽模拟物最低；所有dsDNA与tRNA体系在生理盐浓度下仍稳定。该研究为核酸治疗载体设计提供了手性、核酸结构与离子强度共同调控相行为的准则，论文发表于《Biomolecules》。

关键技术方法方面，研究人员使用三种数均聚合度约50的阳离子聚合物PLK₅₀、PRK₅₀、PNK₅₀，核酸样本为Thermo Fisher提供的鲑鱼精子dsDNA-2000与dsDNA-350、面包酵母tRNA，核苷酸为ATP与CTP。采用电荷分数（charge fraction）固定或扫程设计，在10 mM HEPES缓冲体系中通过浊度测定与光学显微镜观察相分离程度和形貌，并以递增NaCl浓度开展盐抵抗实验，用临界盐浓度描述复合物从相分离回到单相的能力。

3.1 核酸复合物的络合程度与形貌

通过浊度曲线与显微图像，研究人员发现最大浊度出现在电荷分数约0.5处，即正负电荷近等当量时静电作用最强。显微镜显示，三种聚赖氨酸变体与dsDNA均产生不规则致密沉淀，而与tRNA均产生较均匀复凝聚液滴。结论为核酸二级结构主导形貌：刚性双螺旋促进链间堆积和沉淀，tRNA三叶草结构保留水化口袋并支持动态液滴。

3.2 核苷酸复合物的络合程度与形貌

研究人员把ATP、CTP作为核酸最小单元，在零外加盐下改变电荷分数。结果显示，在电荷分数约0.5处络合最强，所有体系均形成复凝聚物而非沉淀。结论为核苷酸缺少核酸式二级结构，作用力平衡偏向液液相分离，不会像长dsDNA那样因相互作用过度汇聚而沉淀。

3.3 盐浓度与骨架排列调控核酸复合物相分离

在电荷分数0.5下递增NaCl，低至中等盐浓度时浊度先升，研究人员解释为盐屏蔽局部强离子接触、增加链运动性并改变水化或粒度，不等于静电结合增强；高盐下Na⁺与Cl^-屏蔽磷酸根与阳离子侧链吸引，并降低凝聚反离子释放的熵收益，复合物水化增强。dsDNA沉淀在远高于生理盐浓度下才溶解，tRNA液滴先在较低盐下转为聚集体，再到更高盐才回到单相。结论为同手性到外消旋到无手性体系临界盐浓度依次下降，骨架排列参与盐稳定性调控。

3.4 盐浓度与环组成调控核苷酸复合物相分离

研究人员对ATP、CTP体系做相同盐梯度。结果是从PLK₅₀、PRK₅₀到PNK₅₀，浊度回到本底所对应的盐浓度逐渐降低；同一聚合物下CTP比ATP更早失相。结论为手性骨架与核苷酸碱基环数共同影响盐稳定性，嘌呤双环结构比嘧啶单环结构更耐盐。

3.5 形貌随盐浓度的变化

研究人员整合显微镜与盐曲线发现，dsDNA体系为低密度沉淀到更小分散沉淀，临界的盐浓度前聚集变稀疏；tRNA体系先增加液滴并润湿孔板，PNK₅₀低盐下甚至出现近熔融形貌，临界的盐浓度前液滴变小、润湿减弱；核苷酸体系无中间固相，直接由复凝聚液滴回到单相。结论为不同聚阴离子与聚合物组合具有特征性盐致形貌轨迹。

3.6 聚赖氨酸与核酸及核苷酸的相空间

研究人员汇总显微镜数据绘制相图与盐抵抗表。结果显示，从同手性、混合手性到无手性，稳定性下降，过渡窗口缩小；tRNA体系中过渡形貌窗口缩小时，沉淀窗口反而扩大。核苷酸体系均从复凝聚直接回单相。结论为相空间由聚合物手性、核酸/核苷酸结构和盐浓度共同划分。

讨论部分总结中，研究人员指出dsDNA刚性强、电荷密，与阳离子聚合物形成沉淀；tRNA更柔曲，形成液滴；无盐时手性不决定络合类型，只影响盐下稳定性。盐稳定性排序为PLK₅₀高于PRK₅₀高于PNK₅₀，因为同手性多肽骨架可主链氢键和有序堆积，外消旋破坏规整堆砌，N-取代多肽模拟物缺乏主链氢键供体且构象异质，协作性堆砌弱。dsDNA在临界盐浓度直接溶解，tRNA先液滴后沉淀再溶解，源于tRNA在盐下可能发生碱基堆积与氢键重排。所有聚赖氨酸变体在150 mM NaCl生理盐浓度下均可维持络合。核苷酸因链短、缺高级结构，盐稳定性低于核酸；ATP等嘌呤核苷酸因氢键位点更多而比CTP等嘧啶核苷酸更耐盐。

结论部分翻译如下：

本研究证明，模型体系中核酸或核苷酸—聚合物复合物的相行为与稳定性，同时受核酸或核苷酸身份和聚合物手性强烈调控。dsDNA始终与赖氨酸基多肽及多肽模拟物形成沉淀，tRNA支持液态复凝聚液滴形成，凸显二级结构引导相结果的作用；核苷酸缺乏二级结构，因此在缺少这些强相互作用时更倾向于复凝聚。

在赖氨酸聚合物变体中，L-同手性聚赖氨酸复合物在递增盐浓度下表现出最大稳定性，强调高离子强度下骨架排列对维持静电作用的重要性。dsDNA复合物从沉淀溶解回单相，tRNA复凝聚液滴先转固体聚集再溶解；ATP与CTP兼具两类特征，形成类似tRNA的复凝聚物，但无dsDNA式中间固相过渡，这可归因于其虽电荷密度高但无骨架。

通过跨体系比较化学计量与盐抵抗，研究建立了聚合物手性、核酸/核苷酸结构与离子强度调控复凝聚对沉淀的明确关联，扩展了对核酸络合的基础认识，并为耐盐、肽基封装平台的设计提供框架。尽管模型分子与治疗货物在序列、尺寸、结构和生物功能上不同，结果仍可作为核酸治疗药物（包括mRNA、siRNA、反义寡核苷酸、引导RNA与质粒DNA）的载体设计规则。更高临界盐浓度可支撑长期递送基质、生物黏附剂和高离子强度水体应用，最终推动稳定高效核酸治疗载体的工程化。