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人巨细胞病毒（HCMV）可在免疫功能低下个体中引起危及生命的疾病。此外，HCMV是病毒相关性先天感染的主要原因。作为八种人类疱疹病毒之一，HCMV尤其与一系列神经功能损害相关，包括小头畸形、听力损失和发育迟缓。鉴于其对早期发育的重大影响，探索当前抗病毒疗法的替
人巨细胞病毒（HCMV）可在免疫功能低下个体中引起危及生命的疾病。此外，HCMV是病毒相关性先天感染的主要原因。作为八种人类疱疹病毒之一，HCMV尤其与一系列神经功能损害相关，包括小头畸形、听力损失和发育迟缓。鉴于其对早期发育的重大影响，探索当前抗病毒疗法的替代方案和补充方案以更好地减轻HCMV相关疾病具有强烈的必要性。与其他疱疹病毒一样，HCMV建立以潜伏期和裂解期交替为特征的终身感染，使病毒能够逃避免疫清除。这些转变伴随着病毒和宿主基因表达的显著变化，进而影响细胞通路和调控机制。环状RNA（circRNAs）最近被鉴定为HCMV转录组的产物，并因其在感染和发病机制中的潜在作用而受到越来越多的关注。本综述重点阐明HCMV来源circRNAs的功能、它们与病毒和宿主转录组的相互作用，以及用于其鉴定和分析的方法学。该领域的最新进展扩展了研究人员对HCMV转录组及其对疾病贡献的理解，突显circRNAs作为未来生物标志物或治疗研究潜在候选分子的可能性。
1. 引言
HCMV，又称人疱疹病毒5型（HHV-5），属于疱疹病毒科β-疱疹病毒亚群。它与其他疱疹病毒共享重要的生物学特征，包括建立终身潜伏感染并在有利条件下再激活的能力。鉴于其对免疫受损个体的重大影响以及作为先天性疾病主要原因的角色，同时有效的预防措施仍然有限，理解HCMV生命周期并开发治疗该病毒的新策略至关重要。近年来，病毒编码的环状RNA（circRNAs）受到越来越多的关注，其在病毒感染和疾病进展中的作用已成为研究的关键领域。本综述的主要目的是考察HCMV circRNAs的具体功能，并探讨其鉴定与分析方法，以总结circRNA研究的最新进展，讨论这些发现如何增进对HCMV转录组的理解，从而为开发靶向这些分子的新型抗病毒策略提供支持。
2. 人巨细胞病毒（HCMV）
人巨细胞病毒（HCMV）感染率高达人群的85%，在人体内建立终身感染，并在免疫功能低下人群中表现出显著的临床影响。与卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和EB病毒（EBV）不同，HCMV未被明确归类为致癌病毒；相反，前期研究提示其参与肿瘤调节（oncomodulation），即可加剧特定癌症中的肿瘤进展和免疫逃逸。HCMV是全球先天性感染的主要原因，并与感音神经性听力损失、神经发育迟缓乃至婴儿死亡等严重并发症相关。健康个体感染HCMV通常无症状或仅表现为传染性单核细胞增多症，但在移植受者、HIV患者及接受化疗的患者等免疫受损个体中，可导致肺炎、视网膜炎、结肠炎和全身性病毒血症等危及生命的疾病。HCMV传播多通过黏膜与感染者体液直接接触发生，母婴垂直传播是先天性感染的主要途径，器官和干细胞移植也是潜在传播方式。HCMV血清阳性率因地理区域、社会经济状况和公共卫生风险因素而异。疾病严重程度受宿主免疫状态强烈影响，HCMV是同时诊断为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）个体中最常见的机会性感染，约占患者临床表现的40%。当前治疗策略包括一线核苷类似物（如更昔洛韦和缬更昔洛韦）和二线药物（如西多福韦和膦甲酸），两者均靶向病毒DNA聚合酶；较新的药物如莱特莫韦（letermovir）已用于造血干细胞移植受者的预防。尽管取得进展，抗病毒耐药性、药物毒性和无法完全清除潜伏病毒仍是重大挑战，目前尚无普遍获批的HCMV疫苗。HCMV拥有人类疱疹病毒中最大的双链线性DNA基因组，约235 kb，编码200多个开放阅读框。其转录组进一步受多种RNA调控，包括信使RNA（mRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）和环状RNA（circRNA）。病毒粒子结构由二十面体衣壳、富含调节蛋白的 tegument 层和带有糖蛋白的脂质包膜组成。HCMV生命周期包括潜伏期和裂解期之间的转换。潜伏期间，病毒基因组主要存在于造血祖细胞和单核细胞中，基因表达极低且不产生感染性病毒粒子；细胞分化、炎症或免疫抑制可触发再激活。裂解周期表现为立即早期（IE）、早期（E）和晚期（L）基因表达的严格调控级联反应，其中IE1和IE2是关键转录调节因子。IL-6驱动的MAPK/ERK和SFK信号通路在促进病毒再激活和基因表达中发挥关键作用。
3. circRNA在宿主和疱疹病毒科中的一般表达
HCMV生命周期中表达多种非编码RNA，构成复杂的调控网络并影响宿主基因转录。circRNAs通常被归类为非编码RNA，因其缺乏5′帽和3′多聚腺苷酸尾。但部分circRNA具有蛋白编码潜力，如circ-ZNF609可在鼠和人类成肌细胞中以剪接依赖或帽非依赖方式翻译。在其他DNA疱疹病毒如KSHV和EBV中，特定circRNAs参与协调调控网络，影响病毒转录组并对宿主调控通路产生反馈效应（如促进病毒再激活或形成肿瘤微环境）。circRNAs的功能包括调控基因表达、海绵吸附microRNA和蛋白，以及作为促进蛋白-蛋白相互作用的结构支架分子。在HCMV感染中，宿主来源差异表达circRNAs可与互补蛋白互作并影响转录后调控过程。例如，hsa_circ_001400在KSHV、EBV和HCMV等疱疹病毒裂解感染中上调，通过PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制凋亡。研究提示circRNA相关特征在DNA病毒中更可能保守，序列相似性高于RNA病毒。然而，关于HCMV编码的具体circRNAs及其与相关病毒的序列保守性，目前知识尚不足以得出与共同祖先保守的确切结论。整体而言，病毒circRNAs的进化保守性低于宿主来源circRNAs，但可能在调控通路水平发生功能趋同。circRNAs在多种疱疹病毒中的存在凸显了其在病毒生物学中的潜在重要性。
4. 病毒基因组转录的circRNAs的生物发生
HCMV来源circRNAs被认为遵循其他DNA病毒中描述的类似机制。生物信息学分析已鉴定出源自HCMV基因组多个区域的circRNAs，表明环化是裂解期病毒基因表达的普遍特征。circRNA生物发生的模型包括一种称为反向剪接（back-splicing）的交替剪接形式，即下游5′剪接供体位点与上游3′剪接受体位点共价连接，通过磷酸二酯键形成闭合环状RNA分子，所得连接点称为反向剪接连接点（BSJ），是circRNA鉴定的决定性特征。两种主要模型解释circRNA形成：套索驱动模型和直接反向剪接模型。在直接反向剪接模型中，侧翼内含子互补序列的碱基配对或反式作用RNA结合蛋白的相互作用使下游剪接供体和上游剪接受体在新生pre-mRNA上靠近，从而在规范剪接之前或同时进行反向剪接。在套索驱动模型中，规范剪接事件（如外显子跳读）产生含外显子的套索中间体，随后进行内部反向剪接产生成熟circRNA。两种情况下，额外加工步骤去除残余内含子序列。宿主来源的剪接机器（包括剪接体小核核糖核蛋白（snRNPs））在介导规范剪接和反向剪接中发挥核心作用。RNA解旋酶和RNA结合蛋白（RBPs）等反式作用因子通过调节RNA二级结构并促进剪接供体和受体位点靠近来促进环化。虽然HCMV中尚未明确定义与其他DNA疱疹病毒circRNA生物发生直接类似的病毒蛋白，但HCMV感染已显示可改变宿主circRNA表达，提示立即早期病毒基因产物可能在调控circRNA生物发生中发挥作用。顺式调控元件（包括反向重复序列等内含子互补序列）可促进侧翼剪接位点靠近，增强反向剪接可能性。一项研究利用WebLogo分析显示，14个HCMV来源circRNAs在受体位点呈现典型“AGN|UNN”基序，在供体位点呈现非典型“NAG|GUN”基序，表明侧翼识别序列在调控circRNA生物发生中的重要性。
5. HCMV circRNA研究中使用的方法学
HCMV和宿主circRNAs的可靠表征依赖于计算发现与严格正交实验验证相结合的综合框架。鉴定方法主要包括：从处理的体外模型中收集初始RNA池、RNase R抗性测定（含线性对照）、通过发散RT-PCR和Sanger测序验证BSJ、排除基因组DNA人工产物，以及通过Northern blot或长读长测序平台进行结构解析。已使用的体外模型包括原代人成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、人白血病单核细胞（THP-1）、胚胎干细胞（ESCs）来源神经祖细胞（NPCs）和人胚胎肺成纤维细胞（HELFs）。富集策略如RNase R处理可降解线性RNA转录本并提高环状转录本检出率，但高度结构化线性RNA（如含G-四链体者）可能抵抗RNase R降解，而过度消化或内切酶污染也有降解真实环状转录本的风险。因此需并行模拟处理对照组，并通过定量GAPDH和ACTB等高表达看家基因的耗竭来评估消化效率。RNA-Seq分析已证明HCMV感染改变病毒和宿主circRNA表达谱。下游验证常用发散引物RT-PCR、Sanger测序和Northern blot。发散引物设计利用头尾环化结构使外向引物跨越BSJ呈收敛方向，从而选择性地扩增环状异构体；但需以基因组DNA（gDNA）为平行对照排除假阳性，并对完整BSJ产物进行Sanger测序。生物信息学管道包括CIRI2（扫描BWA-MEM比对文件中的分裂映射读段）和find_circ（分离未映射读段并通过Bowtie2重新比对末端20核苷酸锚点），通常要求候选circRNA被两种管道同时检出以降低计算假阳性。更精细的算法如CIRIquant加入了额外过滤和验证步骤。候选circRNA须满足严格读段深度过滤（通常≥2个唯一BSJ读段）。circRNA表达量应使用标准化指标（如每百万映射读段的BSJ读数（RPM））或环状-线性比报告。Ularcirc等工具整合BSJ和正向剪接连接点（FSJ）证据及内部外显子使用信息以准确鉴定circRNAs。miRanda软件（v3.3a）已被用于预测miRNA与相关靶标的结合互作。短读长测序在解析全长circRNA异构体和外显子组成方面存在局限，Northern blot可提供基于凝胶的直接验证步骤；长读长测序平台如isoCirc管道通过构建多联体长读段构建体实现BSJ鉴定和全长异构体组装，滚环扩增与长读长测序相结合显著改善了异构体分辨率和检测灵敏度。
6. HCMV circRNAs及其潜在作用
为优先确定功能研究候选circRNAs，研究者常关注具有高丰度、感染不同阶段动态表达变化或预测与调控分子存在互作等特征的转录本。在裂解感染或潜伏期中显著上调的circRNAs可能提示其在病毒复制或持久性中的功能相关性。circRNA-microRNA或circRNA-蛋白相互作用计算预测已用于界定circRNA介导的调控网络。阶段特异性表达模式进一步优化候选选择。目前，HCMV基因组表达的circRNAs已引起越来越多的关注，特别是在其生物发生、裂解期和潜伏期差异表达以及作为miRNA海绵的潜在用途方面。大多数已鉴定HCMV来源circRNAs的确切因果关系尚未建立。
6.1. circUS12
circUS12是在人胚胎肺成纤维细胞（HELFs）裂解感染中转录最丰富的HCMV circRNA，源自US12基因。线性US12病毒蛋白已被实验证明通过ULK1磷酸化和LC3-II转化促进自噬，但circUS12环状转录本的具体生物学功能尚待实验验证。扩增结果显示测序长度存在变异性，提示存在对应于circUS12的多个异构体，表明其源于交替剪接。功能预测显示circUS12共靶向26个人类细胞microRNA分子，这些miRNA与离子结合、蛋白/酶相互作用及转录因子活性等关键细胞过程相关。假设circUS12通过干扰宿主miRNA破坏蛋白支架组装，可能扰乱关键细胞防御机制从而促进有效病毒感染。circUS12的直接调控网络及其在疱疹病毒家族中的保守性尚未完全明确。
6.2. circUL55
circUL55是另一个经验证的HCMV来源circRNA，进入裂解周期后表达上调。验证通过发散引物RT-PCR完成，Sanger测序实验确认了其反向剪接连接点（BSJ），但仅获得circUL55的部分序列。circUL55源自UL55基因，该基因编码主要病毒糖蛋白（gB），是宿主免疫识别的重要靶标。circRNA序列与其线性UL55转录本相同，提示circUL55可能保留编码潜力或与病毒蛋白表达相关的结构特征，但需进一步实验确认。circUL55也存在多个相关异构体。网络分析表明circUL55具有预测的miRNA结合能力，计算模型提示其与参与抗病毒防御通路的宿主microRNAs存在潜在互作，其中33个显著互作之一涉及hsa-miR-191-5p，该miRNA在肾细胞癌和前列腺癌中作为肿瘤抑制因子，而在结肠癌、乳腺癌和胃癌中表现出致癌活性。但circUL55明确上调导致肿瘤发生的因果关系尚未被证实。
6.3. circUL89
circUL89是HELFs裂解感染中高表达的HCMV circRNA之一，源自UL89基因，该位点参与病毒基因组包装。circUL89显著长于许多其他病毒circRNAs，并以单一转录本形式存在，无交替剪接证据，提示其形成在结构上更为保守。序列分析显示circUL89源于反义转录，包含线性UL89转录本的编码区和内含子区。尽管尚无实验验证，生物信息学分析预测circUL89具有广泛的miRNA结合能力，涵盖宿主和病毒microRNAs。有假设认为其表达可能影响内源性UL89表达或调节病毒复制网络，但这些调控作用仍基于基因组组织和靶标预测的理论模型。circUL89的部分靶标与circUS12和circUL55共享，提示其参与免疫逃逸、病毒存活和潜伏建立等多种生物学过程。circUL89预测miRNA相互作用的广度提示其可能作为circRNA-miRNA网络中的中枢调控节点，对宿主抗病毒应答产生广泛影响。circUL89的异位表达实验将有助于探索该circRNA转录的独特生理效应。
7. HCMV感染时差异表达的宿主circRNAs
HCMV潜伏期和裂解期之间的分子转换也影响宿主细胞的转录行为，包括宿主基因组对应circRNAs的表达。针对宿主circRNAs的研究主要关注亲本基因的功能以及感染后circRNA的转录变化。
7.1. circSP100
circSP100在HCMV感染HELFs时上调。其亲本基因SP100与交替剪接相关，编码多种蛋白变异体。SP100蛋白主要定位于早幼粒细胞白血病小体（PML-MBs），已知对病毒基因组转录抑制至关重要。动力学上，circSP100水平在感染后持续升高，而线性SP100 mRNA水平最终下降。结合circSP100的蛋白分析显示共有257种蛋白可与其结合，其中10种由HCMV编码；circSP100结合蛋白的定位为胞质（59%）或核内（37%）。KEGG富集分析表明大量蛋白与剪接体通路相关，提示其对宿主细胞转录调控有明确影响。PRKDC和XRCC6/Ku70等特定蛋白是DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）复合物的关键组分，与抗病毒防御机制相关。
7.2. circMAP3K1
circMAP3K1通过比较模拟感染和HCMV感染细胞间的整体转录而被鉴定。MAP3K1属于特定激酶家族成员，调节JNK激活、泛素化c-Jun和ERK1/2，并参与细胞迁移和凋亡。鉴于特定MAP3K1畸变与多种致癌表型之间的既定关联，推测circMAP3K1外显子区与线性mRNA转录本之间的相互作用可能下调激酶活性，从而导致细胞转化。通过破坏这些调控轴，此类相互作用将理论上促进程序性细胞死亡逃逸，从而维持本应被指定为凋亡清除的细胞谱系的存活。但这一关系在HCMV感染细胞背景中仍需更多研究。
7.3. circPLEKHM1
circPLEKHM1在模拟感染队列中基础转录可忽略不计，而真实HCMV感染的HELFs产生该转录本的显著积累。PLEKHM1参与内吞和自噬所需通路的正向调节。circPLEKHM1在HCMV感染HELFs期间被强烈诱导，其功能表征目前主要来自非病毒癌症模型。在胰腺导管腺癌（PDAC）和肺癌中的独立研究表明，circPLEKHM1可通过与FXR1和PABPC1的相互作用促进肿瘤发生和转移。circPLEKHM1主要定位于细胞质，该空间分布得到缺氧外泌体介导肺癌转移研究的支持，该研究利用荧光原位杂交（FISH）和免疫沉淀测定证实circPLEKHM1与PABPC1的决定性共定位。鉴于该序列在小鼠同源物中的进化保守性，人源化小鼠模型的发展为阐明该circRNA与推测由其上调驱动的特定恶性肿瘤之间的功能相互作用提供了有前景的途径。然而HCMV诱导的circPLEKHM1上调在病毒感染背景下是否发挥类似效应仍有待实验确定。
7.4. circTRIO
circTRIO在模拟感染条件下被鉴定为最丰富的circRNA物种，但感染后几乎无法检测。亲本基因TRIO编码保守的Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子，主要与神经发育和信号通路相关。circTRIO通过荧光原位杂交（FISH）和细胞质/核RNA分级测定确认为主要定位于细胞质。非HCMV相关研究表明，circTRIO在TU212和TU686细胞系（分别源自头颈鳞状细胞癌（HNSCC）和喉鳞状细胞癌（LSCC）的人鳞状细胞癌模型）中显著上调，circTRIO敲低实验导致细胞增殖和肿瘤形成能力降低，表明circTRIO促进这些癌症的生长和进展。HCMV介导的circTRIO耗竭的功能意义以及其代表宿主抗病毒应答还是病毒重定向宿主细胞信号的策略，目前尚不清楚。
7.5. circHIPK3
circHIPK3在HCMV感染后表达发生显著变化。对HCMV感染的人胚胎肺成纤维细胞（HELFs）的转录组分析确定circHIPK3为感染期间显著上调的宿主circRNA。circHIPK3由HIPK3基因外显子2产生，主要定位于细胞质，作为竞争性内源RNA（ceRNA）海绵吸附多个microRNAs并调控下游基因表达。circHIPK3在结直肠癌（CRC）、肝细胞癌（HCC）、胃癌（GC）、胆管癌（CCA）、胆囊癌（GBC）、膀胱癌（BC）、肾癌（RC）、上皮性卵巢癌（EOC）、宫颈癌（CC）、前列腺癌（PCa）、慢性髓性白血病（CML）、胶质瘤和骨肉瘤（OS）等多种恶性肿瘤中表达升高，常作为致癌调节因子促进肿瘤生长、侵袭、转移和治疗耐药。目前证据未证明HCMV感染直接导致特定癌症的发生，但circHIPK3可能具有重要的生物标志物潜力。
8. HCMV相关circRNAs功能表征的当前挑战和未来方向
尽管已通过转录组分析鉴定出众多HCMV相关circRNAs，但目前尚无明确结论表明这些病毒编码因子直接导致特定疾病或恶性肿瘤。现有研究主要集中于表征感染不同阶段的转录组变化、鉴定差异表达病毒和宿主circRNAs并预测其潜在分子相互作用以推断可能的发病机制。未来研究应优先对这些转录本进行与其推测功能相关的实验验证。通过单独抑制特定circRNA转录本的产生，可确认任何由此产生的表型变异或不可控增殖倾向是否与目标circRNA相关。CRISPR-Cas13系统等基因编辑技术可选择性地降解环状RNA转录本，同时最大程度减少对相应线性转录本的干扰；同样，利用Ago2复合物靶向反向剪接连接点（BSJ）序列的RNA干扰（RNAi）方法可在不改变宿主基因表达的情况下实现选择性circRNA耗竭。其他研究途径包括特定候选circRNAs的异位上调。鉴于circHIPK3等circRNAs的功能研究已评估靶向下调或上调是否诱导致癌表型，而HCMV编码的circUS12、circUL55和circUL89的相关研究有限，这些病毒circRNAs的假设功能涉及miRNA海绵作用，
