《Microorganisms》：Design and Evaluation of a Multi-Epitope Vaccine Targeting Conserved Envelope and NS5 Proteins of Usutu Virus Using Immunoinformatics
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乌苏图病毒是一种新出现的蚊媒黄病毒，其地理分布不断扩大，公共卫生相关性日益增加，但目前尚无获许可的疫苗可用。本研究采用整合的反向疫苗学策略，从包膜蛋白和NS5蛋白中鉴定保守的免疫原性区域，并构建多表位疫苗。经过顺序计算筛选，保留的T细胞和B细胞表位满足预定的选
乌苏图病毒是一种新出现的蚊媒黄病毒，其地理分布不断扩大，公共卫生相关性日益增加，但目前尚无获许可的疫苗可用。本研究采用整合的反向疫苗学策略，从包膜蛋白和NS5蛋白中鉴定保守的免疫原性区域，并构建多表位疫苗。经过顺序计算筛选，保留的T细胞和B细胞表位满足预定的选择标准，而所选T细胞表位估计达到96.41%的全球人群覆盖率。最终疫苗由240个氨基酸组成，并结合了一种佐剂和肽连接子。计算表征表明其具有良好的理化特征，以及经优化后立体化学特性改善的三维模型。受体结合分析预测了与TLR2和TLR4的有利相互作用，加权对接分数分别为?1326.1和?1230.2。分子动力学模拟进一步表征了疫苗–TLR2复合物随时间变化的行为，而MM-GBSA分析得出估计结合能为?74.78 kcal/mol。C-ImmSim预测重复抗原给药后体液和细胞免疫应答模式增强，包括模拟抗体水平升高和免疫细胞群体变化。本研究的所有发现均基于计算机模拟分析，代表计算预测而非实验证实的结果。需要进一步的实验验证来确认所提出的候选疫苗的预测特性、免疫原性和保护潜力。
**论文解读：基于免疫信息学的乌苏图病毒多表位疫苗设计与评估**
**1. 研究背景与研究意义**
乌苏图病毒（Usutu virus, USUV）是一种新出现的蚊媒黄病毒，隶属黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），1959年首次在南非分离，并以斯威士兰的乌苏图河命名。该病毒主要通过库蚊属（Culex）蚊虫在蚊虫与鸟类之间传播，具有人兽共患潜力，对野生动物和人类健康构成威胁，且地理分布持续扩大。然而，目前尚无获许可的USUV疫苗或特异性抗病毒疗法，临床治疗以支持性护理为主。既往针对USUV的计算研究主要集中于包膜蛋白（Envelope protein）等单一蛋白上潜在免疫原性表位的鉴定，但缺乏对整合式多表位疫苗的全面结构与分子特征分析。为此，研究人员选取包膜蛋白和NS5蛋白作为靶标，利用整合免疫信息学策略设计并系统评估了一种多表位疫苗，该成果发表于《Microorganisms》期刊。
**2. 主要技术方法**
研究人员从UniProt数据库获取USUV包膜蛋白和NS5蛋白序列（登录号A0A7S5IEW7和A0A075W8L0），经BLASTp从NCBI非冗余蛋白库筛选各200条同源序列用于Shannon熵保守性分析。依次采用ABCPred、NetMHCpan 4.1 EL、NetMHCIIpan 4.1 EL预测B细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助T淋巴细胞（HTL）表位，经VaxiJen、AllerTOP、ToxinPred过滤及BLASTp人类蛋白交叉反应性排除；以IEDB工具评估表位保守性和HLA人群覆盖率。疫苗组装后以ProtParam和SoluProt评估理化性质，AlphaFold3预测三维结构并经GalaxyRefine优化、PROCHECK/ERRAT评估；ElliPro鉴定构象B细胞表位，ClusPro对接TLR2/TLR4受体，Desmond执行100 ns分子动力学模拟，MM-GBSA计算结合能，C-ImmSim模拟免疫应答，最后经密码子优化并计算机克隆至pET-28a(+)载体。
**3. 研究结果**
**3.1 蛋白检索**
经Shannon熵分析，包膜蛋白和NS5蛋白均呈高保守性，大多数残基熵值低于0.5，其中NS5蛋白较包膜蛋白更为保守。两种蛋白均预测为抗原性且非致敏；包膜蛋白含跨膜区段，NS5蛋白无跨膜螺旋。
**3.2 表位预测**
经顺序筛选，从包膜蛋白获得2个线性B细胞表位、6个CTL表位（包膜蛋白与NS5蛋白）和3个HTL表位，所有表位均满足抗原性、非致敏、无毒及HLA结合百分位阈值要求。
**3.3 表位保守性分析**
针对200条同源序列的IEDB保守性评估显示，NS5蛋白来源的5个表位在全部序列中100%保守；包膜蛋白来源表位保守性介于93.5%–99.5%之间，其中GLMGALLLW完全保守。
**3.4 表位人群代表性评估**
IEDB人群覆盖工具分析表明，所选CTL和HTL表位全球预测覆盖率为96.41%，北美（98.25%）、欧洲（98.19%）和东亚（98.18%）最高，南非最低（78.58%）。
**3.5 多表位疫苗构建**
疫苗由240个氨基酸组成，依次包含人β-防御素-3佐剂、EAAAK连接子、B细胞表位（KK连接子）、CTL表位（AAY连接子）、HTL表位（GPGPG连接子）、PADRE序列及C端6×His标签，整体预测为抗原性且非致敏。
**3.6 理化特性表征**
ProtParam预测显示疫苗具有低不稳定指数、高脂族指数和负GRAVY值；SoluProt评分为0.861，预测该蛋白可溶，适合重组表达。
**3.7 三维结构预测与质量评估**
AlphaFold3预测pTM评分为0.20。经GalaxyRefine优化后，Ramachandran图中favored区域残基比例由88.1%升至98.4%，ERRAT质量因子由85.34%提升至92.86%，立体化学质量显著改善。
**3.8 基于结构的构象B细胞表位定位**
ElliPro在疫苗三维结构中鉴定出10个不连续B细胞表位区域，突出指数范围为0.534–0.836，提示多个暴露于表面的潜在抗体识别位点。
**3.9 疫苗–受体相互作用评估**
ClusPro对接显示疫苗与TLR2、TLR4的加权对接分数分别为?1326.1和?1230.2。TLR2复合物界面涉及26个TLR2残基与27个疫苗残基，含11个氢键、1个盐桥和202个非键接触；COCOMAPS进一步确认界面以近端接触、CH–O/N键和疏水范德华相互作用为主。
**3.10 分子动力学模拟**
100 ns轨迹显示，TLR2（Protein A）RMSD约4–8 ?，波动较小；疫苗组分（Protein B）RMSD和RMSF显著更高，可能与柔性连接子有关。复合物回旋半径在40 ns后稳定于33–34 ?；MM-GBSA计算结合能为?74.78 kcal/mol，其中库仑相互作用贡献?382.90 kcal/mol。
**3.11 免疫应答计算评估**
C-ImmSim模拟350天免疫方案预测，重复给药后IgM和IgG水平升高，记忆B细胞持续存在，CTL群体出现变化，IFN-γ和IL-2水平增加，提示疫苗可诱导增强的体液和细胞免疫应答模式。
**3.12 密码子优化与计算机克隆**
优化后GC含量从65.20%降至59.65%，CAI值为0.73，表明对E. coli K12具有中等密码子适应性；含NdeI/XhoI酶切位点的序列成功克隆至pET-28a(+)载体。
**4. 讨论总结与结论翻译**
讨论部分指出，包膜蛋白提供抗体识别靶点，而NS5蛋白提供细胞免疫表位来源，二者互补。所选表位无人类蛋白完全序列匹配，但IPISIVASL、VQKLGYILR和KIPISIVASLSDLTP存在7个氨基酸的局部匹配，需实验评估其生物学意义。分子动力学中疫苗组分的高柔性可能与接头区和多表位组成有关，PAE和pTM提示结构预测需谨慎解读。所有计算发现均为预测性结果，不能完全反映抗原加工、体内折叠和免疫机制，未来需延长模拟时间并增加重复模拟，并开展重组表达、HLA呈递、TLR2应答、交叉反应性及体内免疫原性和保护力研究。结论部分可译为：本研究利用包膜蛋白和NS5蛋白的选定区域，设计了一种经计算优先排序的乌苏图病毒多表位疫苗。所选表位显示出良好的预测抗原性、高保守性、广泛的预测HLA人群覆盖率以及合适的预测理化性质。结构建模、TLR相互作用分析、分子动力学模拟、MM-GBSA分析和免疫模拟为进一步研究该候选疫苗提供了额外的计算信息。然而，本研究完全采用计算机模拟方法进行，研究结果代表计算预测而非实验证实的结果。需要进一步的实验验证来确认预测的特性，并确定观察到的结果是否能在生物条件下重现。实验验证应包括重组蛋白表达与纯化、结构表征、表位加工与HLA呈递、免疫识别、TLR2相关应答、交叉反应性与安全性评估，随后进行免疫原性和保护性能的体内评价。因此，该构建体应被视为经计算优先排序的疫苗候选物，其生物学和保护潜力有待实验室和临床前验证。
