西班牙南部三种蝙蝠在不同环境中的病毒组多样性

《Microorganisms》：Virome Diversity in Three Bat Species in Different Environments in Southern Spain

　　

病毒是全球生物多样性的重要组成部分，并深刻影响宿主种群与群落的生态和进化进程。蝙蝠物种丰富度高且生态类型多样，为研究宿主特征与环境背景如何塑造病毒群落结构提供了理想体系。本研究利用宏基因组学方法，对西班牙南部两种不同环境中三种蝙蝠物种——库氏伏翼（Pipistrellus kuhlii）、伊比利亚灰蝠（Cnephaeus isabellinus）和大夜蝠（Nyctalus lasiopterus）——的病毒组多样性进行了系统表征。两个采样环境分别为保存完好的地中海森林（卡索拉-塞古拉-拉斯维利亚斯自然公园，CSVNP）和受人为改造的湿地-农业系统镶嵌体（多尼亚纳国家公园，DNP）。宏基因组分析共检出72种真核病毒物种，涵盖哺乳动物、昆虫、蛛形纲及植物相关病毒。病毒丰富度与群落组成在不同样本、蝙蝠物种及环境间均存在差异。其中，P. kuhlii样本的病毒丰富度最高，主要由昆虫相关病毒驱动；C. isabellinus样本中脊椎动物相关病毒贡献比例较高；而N. lasiopterus的病毒丰富度最低。CSVNP样本表现出更高的病毒丰富度和更多特有类群，而DNP样本丰富度较低，但节肢动物相关病毒占比更大，可能反映了猎物群落的差异。尽管如此，两种环境间的多样性指标相近，表明其病毒群落结构上具有可比性，但组成类群截然不同。蝙蝠病毒组特征与宿主生态、营养行为及环境背景密切相关。

《西班牙南部三种蝙蝠在不同环境中的病毒组多样性》论文解读

一、研究背景与科学问题

病毒是地球上多样性最高、数量最丰富的生物实体，广泛存在于几乎所有生物体与环境中，并在宿主进化、种群动态和群落结构塑造中发挥核心生态与进化功能。与此同时，部分病毒具有跨物种传播能力，可引发新宿主的疾病甚至死亡，构成重大公共卫生威胁。历史上，病毒学研究长期聚焦于与人类直接相关的动植物病毒，而对野生动物病毒多样性的认知严重不足且存在显著类群偏倚。蝙蝠作为唯一能够飞行的哺乳动物，凭借其独特的生态与进化特征——包括飞行带来的远距离移动能力、超常寿命、群居习性以及能有效控制病毒复制且炎症反应有限的免疫系统——被公认为携带异常多样病毒群落的储库类群。迄今已在蝙蝠中鉴定出至少33个病毒科的病毒，其中包含与亨德拉病毒、尼帕病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒以及SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV等 zoonotic 疫情相关的病毒。

然而，蝙蝠携带的病毒丰富度并非均匀分布于各物种之间，不同蝙蝠类群间在病毒丰富度和病毒组组成上均存在显著差异。现有证据表明，蝙蝠病毒组受多种交互作用的因素影响，包括宿主饮食类型、移动模式、种群统计学特征、交配策略、窝仔数、寿命、性别、年龄、系统发育多样性及种群遗传结构等。此外，宿主-病毒互作发生在日益受人类活动改造的生态系统中——森林砍伐、栖息地破碎化、城市扩张、农业集约化和畜牧业发展已从根本上改变了自然生态系统的结构、物种丰度与分布格局，进而通过改变接触网络、资源可利用性和群落组成来重塑野生动物群落内部的生态互作，包括宿主与病毒之间的互作关系。

在此背景下，开展跨宿主物种、跨环境类型的比较研究，对于解析病毒组组成的塑造机制具有重要科学价值。本研究选取三种系统发育关系密切但生态特征迥异的蝙蝠科物种——小型、定居、广食性昆虫食性的库氏伏翼（Pipistrellus kuhlii）；中型、主要定居的伊比利亚灰蝠（Cnephaeus isabellinus）；以及大型、季节性迁徙、以昆虫为主食但具有独特季节性捕食候鸟营养策略的大夜蝠（Nyctalus lasiopterus）——在西班牙南部两个生态条件截然不同的环境中进行系统采样，旨在探究宿主生态特征与环境条件如何共同影响蝙蝠病毒组的多样性与组成。研究假设病毒多样性会因物种生态特征不同而存在差异，且在受人为改造的环境中因生态互作改变和跨物种病毒交换机会增加而更高。该研究成果发表于《Microorganisms》期刊。

二、关键技术方法

研究人员于2023年5月至7月和2024年5月在西班牙南部两个研究地点——保存完好的地中海森林CSVNP（卡索拉-塞古拉-拉斯维利亚斯自然公园）和受人为改造的湿地-农业镶嵌体DNP（多尼亚纳国家公园）——采集了三种蝙蝠共78个个体样本，采集方式为雾网法，采集时间为19:00至00:00。样本类型包括唾液（口咽拭子）和粪便，按样本类型、蝙蝠物种和采集环境进行混合建库，每池最多5只个体，共构建36个文库。核酸提取前对样本进行差速离心和逐级过滤以去除真核细胞遗传物质，唾液样本额外进行核酸酶处理以降低宿主核酸背景。文库构建采用NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit，在NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序。生物信息学分析采用viralrecon v2.6.0流程，经质量评估、修剪、宿主序列过滤（Kraken 2，参考基因组涵盖5种蝙蝠）、de novo组装（SPAdes）、病毒序列鉴定（BLAST比对NCBI病毒核苷酸数据库）及参考基因组比对验证等步骤，最终保留与参考基因组比对reads≥100且覆盖≥300 nt的病毒序列。病毒多样性分析采用丰富度（S）、均匀度（E）、Shannon多样性（H′）及Hill数（q = 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8）等多维度指标，在病毒物种和病毒科两个分类水平上进行评估。

三、研究结果

3.1 病毒组整体特征

经测序和质量过滤，21个文库通过全部质控标准并纳入后续分析，包括P. kuhlii 8个池（CSVNP 4个、DNP 4个）、C. isabellinus 8个池（CSVNP 5个、DNP 3个）和N. lasiopterus 5个池（CSVNP 4个、DNP 1个）。测序共产生2,349,723,463条原始reads，其中8,592,931条被归类为真核病毒序列。共检出72种推定病毒类群，其中26种（36.1%）与参考序列的核苷酸一致性≥95%，被认定为已鉴定病毒；其余46种（63.9%）保留为推定病毒类群。55种病毒归属于19个病毒科，17种无已知分类学归属。19个病毒科中，8个为DNA病毒科，11个为RNA病毒科。按宿主类型划分，45.83%的病毒物种与昆虫相关，40.28%与脊椎动物相关，6.94%与植物相关，2.78%与蛛形纲相关，4.17%为环境样本中检出的病毒。大多数病毒（81.90%）局限于特定的物种-栖息地组合。

3.1.1 脊椎动物病毒

共鉴定出29种脊椎动物相关病毒类群，分布于12个病毒科，包括腺病毒科（Adenoviridae）、星状病毒科（Astroviridae）、环状病毒科（Circoviridae）、冠状病毒科（Coronaviridae）、基因组病毒科（Genomoviridae）、肝炎病毒科（Hepeviridae）、Kanorauviridae、Mahapunaviridae、乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）、细小病毒科（Parvoviridae）、多瘤病毒科（Polyomaviridae）和逆转录病毒科（Retroviridae）。部分病毒科局限于特定宿主或环境，如腺病毒科仅在CSVNP的P. kuhlii中检出，星状病毒科和逆转录病毒科仅在DNP的C. isabellinus中检出；而环状病毒科和冠状病毒科在CSVNP的所有三种蝙蝠中均有检出。环状病毒科的Cyclovirus jemage是丰度最高的脊椎动物相关病毒。

3.1.2 昆虫病毒

共检出33种昆虫相关病毒类群，其中20种归属于8个病毒科，其余13种无分类学归属。这些病毒与蜻蜓目、半翅目、鳞翅目、膜翅目、鞘翅目和双翅目昆虫相关。部分病毒科为单一宿主或环境特有，如Alphatetraviridae仅在CSVNP的P. kuhlii中检出，Chuviridae仅在DNP的P. kuhlii中检出，Flaviviridae仅在CSVNP的N. lasiopterus中检出。环状病毒科的Cyclovirus vazka丰度最高，在CSVNP的所有三种蝙蝠中均有检出。

3.1.3 蛛形纲病毒

两种未分类的蜘蛛相关病毒（Hubei picorna-like virus 62和Wuhan spider virus 3）仅在DNP的P. kuhlii中检出。

3.1.4 植物病毒

检出5种植物相关病毒类群，归属于Solemoviridae和Virgaviridae科及一个未分类类群，包括Sobemovirus SOMV、三种烟草花叶病毒属（Tobamovirus）物种和Cherry virus Trakiya。Sobemovirus SOMV仅在N. lasiopterus中检出，Virgaviridae物种局限于CSVNP。

3.2 病毒多样性比较分析

P. kuhlii样本共检出37种病毒物种和9个病毒科，其中CSVNP检出24种（7科），DNP检出17种（3科），两个环境共享3种双顺反子病毒科（Dicistroviridae）物种。CSVNP的病毒丰富度和Shannon多样性均高于DNP，但多样性曲线在较高q值处收敛，表明两个环境共享相似的優勢病毒类群，Shannon多样性差异不显著（p = 0.5653和0.3062），环境间差异主要由丰富度和稀有病毒类群的贡献驱动。

C. isabellinus样本检出31种病毒物种和14个病毒科，CSVNP检出22种（10科），DNP检出9种（6科）。CSVNP虽然物种丰富度明显更高，但均匀度和Shannon多样性较低，表明存在少数优势类群的强主导；DNP病毒丰富度较低但均匀度和Shannon多样性较高。Shannon多样性差异不显著（p = 0.9012和0.4526），Hill多样性曲线在CSVNP中随q值增大下降更陡峭，支持丰富度-优势度权衡模式。

N. lasiopterus在CSVNP中病毒多样性最低，检出14种病毒物种和7个病毒科；DNP仅1个文库通过质控，检出1种病毒，多样性估计值不进行解读。

环境间比较显示，CSVNP检出51种病毒物种和15个病毒科，其中45种为该环境特有；DNP检出27种病毒物种和9个病毒科，其中21种为该环境特有。尽管多样性指数在环境间无显著差异，但病毒群落组成差异显著，反映了病毒类群组成而非优势度或均匀度的差异。

四、讨论与结论

4.1 不同蝙蝠物种间的病毒多样性

P. kuhlii表现出最高的病毒丰富度，主要受昆虫相关病毒驱动，与其广食性、广泛的生态耐受性和地理分布范围相关。该物种占据欧洲几乎所有主要生物地理区域，包含多个遗传谱系，这些特征与蝙蝠病毒多样性增加相关联。P. kuhlii的高病毒丰富度与其饮食广谱性一致，检出的多种昆虫相关病毒对应其猎物类群，包括农业害虫相关病毒。值得注意的是，P. kuhlii作为三种蝙蝠中体型最小的物种却拥有最高病毒丰富度，与以往报道的体型与病毒多样性正相关的模式相悖，可能反映了本研究数据集中昆虫来源病毒占主导的特征。

C. isabellinus的病毒谱以昆虫相关病毒为主，与其节肢动物猎物组成一致。检出的Blattambidensovirus incertum1（细小病毒科）系统发育分析表明其属于昆虫相关densovirus谱系，鸟类并非其天然宿主，原始检出很可能反映饮食获取而非真实宿主关联。该物种未检出弹状病毒（rhabdoviruses），尽管其被认定为南伊比利亚欧洲蝙蝠狂犬病毒1型（EBLV-1）的主要储库，但这与自然蝙蝠种群中EBLV-1通常低流行的特征一致。

N. lasiopterus在CSVNP中病毒多样性最低，这一结果出乎意料，因其为欧洲最大型蝙蝠之一且具有长距离移动和广泛觅食范围。类似现象在瑞士的近缘种N. leisleri和N. noctula中也有报道，提示Nyctalus属可能存在属级水平的病毒多样性模式。尽管总体丰富度较低，该物种脊椎动物相关病毒比例相对较高，与其他迁徙性欧洲蝙蝠的模式一致。

4.2 不同环境间的病毒多样性

CSVNP在物种和科水平上的病毒丰富度均高于DNP，但Shannon多样性和Hill数在环境间相近，表明相似的有效多样性值并非由相同病毒类群驱动，而是源于可比的优势度结构，反映出高组成周转而无有效多样性显著变化。该结果不支持研究初始假设——即环境改造景观中病毒多样性更高。保守栖息地通常支持更多样的脊椎动物群落，增加宿主间接触机会，通过更复杂的生态网络促进病毒传播。DNP病毒丰富度较低但节肢动物相关病毒占比更大，反映了当地节肢动物群落组成的差异，强调了猎物群落在塑造食虫蝙蝠病毒组特征中的关键作用。

4.3 研究局限与展望

混合建库设计虽降低了测序成本并提高了低丰度病毒检出概率，但丧失了个体水平分辨率，限制了对病毒流行率、共感染及个体间变异性的评估。个体间病毒载量差异可能引入组成偏倚。严格的质控过滤减少了可用于分析的文库数量，限制了部分物种-环境比较的样本量。病毒序列分类学分配方面，核苷酸一致性<95%的序列被保守地归类为推定病毒类群，可能反映与现有参考序列的差异或病毒数据库的空白。未来研究应扩展地理和环境梯度采样范围，结合靶向分子检测和病毒分离等手段，以区分瞬时饮食信号与真实宿主-病毒互作。

五、研究结论

本研究是对伊比利亚半岛不同环境中蝙蝠样本病毒组的首次比较评估。CSVNP样本表现出更高的病毒丰富度和更广泛的病毒科代表性，但更高的病毒多样性并不必然意味着更高的公共卫生风险；DNP样本总体携带较少病毒类群，但包含此前在湿地环境特征类群中报道的病毒。尽管存在这些差异，两种环境间的有效多样性指标总体可比，表明丰富度与优势度之间存在补偿性动态。重要的是，相近的多样性值并不反映相同的病毒类群，每种环境支持一个组成截然不同但优势与稀有病毒结构分布可比的病毒群落。在物种水平上，三种蝙蝠的病毒组组成存在差异：P. kuhlii病毒丰富度最高，可能与其生态广适性和广谱饮食相关；C. isabellinus呈中间型特征，以与猎物消费相关的昆虫相关病毒为主导；N. lasiopterus尽管体型大且具迁徙行为，病毒多样性却相对较低。综合来看，蝙蝠样本中检出的病毒多样性与栖息地结构、宿主生态和营养途径之间的互作密切相关。