培养基组成与光照强度塑造弯叶画眉草成熟胚茎尖的替代形态发生途径

《Plants》：Culture Medium Composition and Light Intensity Shape Alternative Morphogenic Pathways from the Mature Embryo Shoot Apex of Eragrostis curvula

　　

弯叶画眉草（Eragrostis curvula）是一种多年生C₄牧草，也是无融合生殖（apomixis）的模式物种，其遗传转化和基因组编辑仍因缺乏高效的再生体系而受到制约。本研究评估了诱导阶段培养基组成和光照强度对cv. Tanganyika INTA成熟胚外植体形态发生反应的影响。共测试了11种培养基：9种设计用于诱导体细胞胚样结构（somatic embryo-like structures, SELSs；第1组），2种用于促进多重芽增殖（第2组）。在8周诱导期内施加4种光照制度——低光、中光、高光和黑暗。在培养皿水平记录有反应和无反应的外植体，并使用R 4.5.0中的二项广义线性模型（generalized linear models, GLMs）在各功能组内分别进行分析。形态发生反应起源于胚轴顶端区域，该区域包含茎尖分生组织（shoot apical meristem）。培养基组成影响主要的形态发生反应类型，而光照强度影响反应效率（培养基×光照交互作用显著）。培养基I（WPBS + 2,4-D + 低浓度BAP）在中光条件下在第1组中产生最高的形态发生反应，估计60.6%的外植体表现出SELSs和/或相关的成芽分生组织，尽管该估计值与相同培养基在低光和高光条件下获得的结果在统计学上无法区分。培养基J（WPBS + 高BAP:2,4-D比）在中光条件下产生74.0%的多重芽增殖反应。黑暗降低了两个组中的形态发生反应。这些方案为未来弯叶画眉草的遗传转化和基因组编辑研究提供了可重复的再生平台。

**研究背景与存在问题**

弯叶画眉草（Eragrostis curvula）又称垂爱草，是一种多年生暖季型C₄禾本科牧草，原产于南部非洲，已在南美洲、北美洲和澳大利亚的干旱与半干旱地区归化。在阿根廷，该草覆盖数百万公顷，凭借其耐旱性、对贫瘠土壤的适应能力、高生物量产量和护坡能力，成为边际环境中粗放畜牧业的关键饲料资源。除农艺价值外，弯叶画眉草还是研究无融合生殖（apomixis）的模式物种，因为该属同时包含有性二倍体和无融合多倍体。尽管该物种具有重要性，但其对离体组织培养的顽拗性限制了现代生物技术的应用。此前报道的转化方案基于cv. Ermelo的叶片和种子来源愈伤组织基因枪转化，稳定转化频率为13%，但该方案依赖器官发生途径且仅针对单一基因型，不适合高通量应用，至今尚未建立高效、基因型无关的转化体系。因此，开发高效且可重复的再生体系是改进转化策略（包括基因枪导入、农杆菌介导转化和CRISPR/Cas9基因组编辑）的必要前提。茎尖分生组织（shoot apical meristem, SAM）是禾本科植物株型构建的中心组织，近年来已成为谷物遗传转化的可持续外植体，提供了比未成熟胚胚性愈伤组织更低基因型依赖性的替代方案。成熟胚全年易于获取，在其他顽拗物种中已实现快速、不问基因型的芽再生。然而，培养基组成和光照强度能否将弯叶画眉草成熟胚芽尖区域导向不同的形态发生途径，此前尚未得到研究。

**研究内容与结论**

研究人员以弯叶画眉草cv. Tanganyika INTA成熟胚为唯一外植体来源，系统评估了诱导阶段培养基组成和光照强度对形态发生反应的影响。结果表明，培养基组成决定主导的形态发生反应类型（体细胞胚样结构相关诱导 vs 多重芽增殖），而光照强度影响反应效率，且二者交互作用显著。该研究提供了可重复的再生平台，为弯叶画眉草未来的遗传转化和基因组编辑研究奠定了基础。论文发表在《Plants》。

**关键技术方法**

研究人员使用成熟种子（品种cv. Tanganyika INTA）表面灭菌后剥离的成熟胚作为唯一外植体来源。共设计11种诱导培养基（A–K），分为两个功能组：第1组（A–I）分别基于tef优化的愈伤诱导培养基、MSD配方和WPBS-B配方设计，用于诱导体细胞胚样结构（SELSs）；第2组（J、K）分别基于WPBS-B和小麦SM2.5芽增殖培养基，用于多重芽增殖。施加4种光照强度（29.4、55.2、107.4 μmol m^?2·s^?1及完全黑暗），16/8小时光周期，诱导期约8周。在培养皿水平统计有/无反应外植体，使用R 4.5.0中的二项广义线性模型（GLM）进行Type III偏差分析，通过估计边际均值和Sidak校正成对比较评估处理效应。

**研究结果**

2.1 培养建立过程中的形态变化：在中光（55.2 μmol m^?2·s^?1）下于Medium A培养的成熟胚外植体，培养前2天胚芽鞘和第一叶原基伸长而根区发育微弱；8–14天非形态发生组织逐渐覆盖胚轴顶端区域；约15天起出现致