发根农杆菌（*Agrobacterium rhizogenes*）介导的油茶（*Camellia oleifera*）非组织培养毛状根转化系统的开发与优化

《Plants》：Development and Optimization of a Non-Tissue Culture Hairy Root Transformation System in Camellia oleifera Mediated by Agrobacterium rhizogenes

　　

油茶（*Camellia oleifera*）是中国特有的重要木本油料作物物种。然而，常规农杆菌（*Agrobacterium*）介导的转化系统效率低下，严重制约了油茶的基因功能分析和分子育种研究。本研究利用优良品种‘湘林210’建立了一种快速高效的发根农杆菌（*Agrobacterium rhizogenes*）介导的毛状根转化系统。研究人员将携带RUBY可视化报告基因的载体导入叶片和下胚轴外植体，系统评估了三种农杆菌菌株（GV3101、MSU440和K599）的转化效率，并进一步优化了关键转化参数，包括菌悬液浓度和真空渗透时间。结果表明，叶片外植体的转化效率显著高于下胚轴外植体；在供试菌株中，K599表现出最高的毛状根诱导效率；最佳转化条件为菌悬液OD₆₀₀ = 0.8结合真空渗透40 min。在此条件下，毛状根诱导率达到69.00%，RUBY阳性毛状根比例达到58.00%。值得注意的是，整个转化过程无需愈伤组织诱导或植株再生，在60天内即可获得稳定的转基因毛状根。总之，本研究展示了一种快速且不依赖组织培养的油茶毛状根转化方案。尽管仍需进一步的功能研究，该平台为未来油茶候选基因验证和功能基因组学研究提供了具有强大潜力的实用工具。

油茶发根农杆菌介导的非组织培养毛状根转化体系研究解读

油茶（*Camellia oleifera*）是中国特有的重要木本油料树种，其种子中不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸的90%以上，享有“东方橄榄油”的美誉，具有显著的经济、营养和生态价值。随着全基因组测序以及转录组、代谢组等多组学研究的快速推进，研究人员已在油茶中鉴定出大量与油脂生物合成、逆境响应、养分获取和根系发育相关的候选基因，为分子育种奠定了重要基础。然而，候选基因的鉴定并不足以确定其生物学功能或育种价值，功能验证仍是连接基因组发现与分子育种策略的关键环节。由于缺乏高效的遗传转化平台，油茶候选基因的功能研究长期依赖拟南芥等异源系统，严重制约了功能基因组学和分子育种的进展。

常规根癌农杆菌介导的稳定转化体系通常依赖组织培养流程，包括愈伤组织诱导、不定芽再生和转化体筛选。但在油茶等多年生木本植物中，外植体严重褐变、再生效率低、基因型依赖性强等问题导致转化效率低、实验周期长、重复性差。已有研究人员利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）在油茶近缘种中实现部分基因的瞬时功能验证，但无法获得稳定转基因材料。近年来，发根农杆菌介导的毛状根转化因无需植株再生、显著缩短转化周期，已成为难转化植物基因功能研究的有效替代途径，并在西番莲、猕猴桃、山梨等多种木本植物中成功应用。在山茶科植物中，茶树已建立基于发根农杆菌菌株ATCC15834的毛状根转化体系，并在35–50天内获得转基因毛状根，实现了CRISPR/Cas9基因组编辑和基因功能验证。然而，油茶中尚无高效的毛状根转化体系报道。

针对上述瓶颈，本研究以油茶优良品种‘湘林210’为材料，旨在建立一种快速、高效、不依赖组织培养的发根农杆菌介导毛状根转化系统。研究人员引入携带RUBY可视化报告基因的p3302-RUBY载体，比较了叶片和下胚轴外植体的转化效果，系统评估了GV3101、MSU440和K599三种农杆菌菌株的转化效率，并进一步优化了菌悬液浓度（OD₆₀₀ = 0.6、0.8、1.0）和真空渗透时间（20、40、60 min）等关键参数。该研究成果发表于《Plants》期刊。

本研究采用的主要关键技术方法包括：以‘湘林210’幼苗为试材，将其种植于南京林业大学人工气候室，在16 h光照/8 h黑暗、24 ± 2 °C、相对湿度70–85%条件下培养；采用冻融法将p3302-RUBY载体导入三种农杆菌菌株；利用真空渗透法侵染带完整叶柄的叶片和下胚轴外植体，在蛭石基质中共培养诱导毛状根；基于RUBY基因编码的甜菜碱生物合成途径（包括CYP76AD1、DODA和葡萄糖基转移酶三个酶）实现转基因根的可视化筛选；通过CTAB法提取基因组DNA并进行PCR扩增验证转基因整合；利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测RUBY转录水平；统计分析采用二项广义线性模型（generalized linear model, GLM）和Tukey多重比较。

研究结果部分涵盖以下四个方面的内容。在建立不依赖组织培养的毛状根转化体系方面，感染后60天，叶片和下胚轴外植体伤口处均成功诱导出毛状根，RUBY阳性根因积累甜菜碱色素呈现红色，非转基因根为乳白色。叶片外植体的生根外植体数平均为11.00个，显著高于下胚轴；毛状根诱导率达22%，为下胚轴的3.1倍（p < 0.05）；RUBY阳性转化率为25%，虽高于下胚轴的11%，但差异未达显著水平。叶片来源的毛状根生长更为健壮，RUBY色素沉着更强。在菌株比较方面，三种菌株均能诱导毛状根，但GV3101诱导能力极低，平均生根外植体仅1.33个，诱导率3%，且未检测到RUBY阳性根；MSU440和K599的诱导率分别达35%和41%，均显著高于GV3101；K599的RUBY阳性转化率最高（24%），高于MSU440的14%，两者差异不显著。综合确定K599为最优菌株。在感染条件优化方面，二项GLM分析显示菌液浓度和真空渗透时间均显著影响诱导效率，且二者存在显著交互作用。OD₆₀₀ = 0.8结合40 min真空渗透处理表现最优，平均产生34.33个生根外植体，毛状根诱导率69%，RUBY阳性转化率58%，均显著高于其他处理。相同菌液浓度下，随渗透时间从20 min延长至40 min诱导率从63%升至69%，60 min时降至25%。过高的菌液浓度和过长的真空处理导致外植体严重褐变坏死。在分子验证方面，16个随机选取的RUBY阳性毛状根均经PCR扩增出368 bp的RUBY特异条带，野生型根无扩增产物，无非特异性条带。qRT-PCR结果显示，红色毛状根中RUBY转录水平显著高于野生型根和白色毛状根，证实了红色表型由高水平的RUBY转录驱动。

讨论部分指出，所建立的毛状根体系属于“复合植物”模式，即仅根系为转基因状态，地上组织保持非转基因，因此特别适用于根系发育、养分吸收、根际互作和逆境响应相关基因的功能研究。叶片外植体优于下胚轴可能与其解剖生理特性有关，叶片薄壁细胞比例高、分裂活性强、木质化程度低，有利于农杆菌附着和T-DNA转移。K599菌株的高侵染性可能与其来源于A4 Ri质粒谱系、具有强根诱导能力有关，但宿主与细菌互作存在基因型依赖性，在其他油茶品种中的转化效率仍需验证。真空渗透通过促进农杆菌穿透致密组织增强T-DNA递送效率，但渗透时间过长会造成组织脱水和细胞损伤。RUBY系统无需破坏性染色、外源底物或荧光检测设备，显著提高了阳性材料筛选效率，但甜菜碱积累受启动子活性、插入位置和酪氨酸前体供给影响，仍建议结合PCR或qPCR进行最终确认。该平台当前在‘湘林210’品种上完成系统优化，初步实验显示可应用于其他山茶种质，但大范围基因型验证以及与基因过表达、RNA干扰和CRISPR/Cas9编辑技术的整合仍是未来重要方向。

综上所述，本研究开发并系统优化了一种高度可重复且不依赖组织培养的发根农杆菌介导毛状根转化系统。实验证据表明：叶片外植体在诱导率上优于下胚轴外植体；菌株K599相比MSU440和GV3101表现出更优的转化效率；OD₆₀₀ = 0.8结合40 min真空渗透为最佳条件，可在60天内实现69.00%的毛状根诱导率和58.00%的RUBY阳性转化率。该优化方案为未来油茶候选基因筛选、启动子特征分析和养分转运研究奠定了技术基础，也为油茶及其他木本山茶属植物的功能基因组学和分子育种研究提供了重要工具。