低温–活性氧–激素协同调控文冠果种子休眠释放与萌发

《Plants》：Low Temperature–ROS–Hormones Co-Regulation of Seed Dormancy Release and Germination in Xanthoceras sorbifolium

　　

摘要 种子休眠是植物重要的适应性机制。然而，部分种子，如文冠果（Xanthoceras sorbifolium，一种具有重要经济和药用价值的物种），表现出强烈的休眠特性，导致自然萌发率极低。本研究探讨了低温（LT：?20 °C贮藏60天）解除种子休眠并促进萌发的机制。研究通过检测种子萌发条件、应用扫描电子显微镜（SEM）、测定种子生理指标及激素水平，并对糖和脂肪酸代谢进行了靶向代谢组学分析。结果如下：（1）低温条件下观察到47.3%的高萌发率，而室温（RT：25 °C）条件下仅为32.7%。在四种萌发方法中，直接湿沙萌发（GMS）最为有效。（2）贮藏后（VI期）和萌发第7天（VII期）是打破种子休眠和触发萌发的关键阶段。在两个阶段，SEM观察到种壳和种仁——尤其是种仁——具有高完整性。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，以及吲哚乙酸（IAA）和异戊烯基腺嘌呤（IPA）的水平，IAA/ABA比值和（IAA + GA3 + ZR + IPA）/ABA（tHor/ABA）比值均较高，尤其是在VII期，与RT处理相比，LT处理下tHor/ABA比值增加了62.7%，而ABA下降了23.2%。最佳萌发条件（GMS）创造了适宜的微环境，可维持高活性的抗氧化酶并将H2O2（活性氧（ROS）的一种）保持在信号转导水平，并与激素发生交叉对话。这些变化（酶、激素、ROS和微环境）确保了种子在VI期达到休眠释放的最佳状态，并促进了VII期的种子萌发。（3）LT处理促进了种子中淀粉和脂肪的降解。观察到八种可溶性糖（如葡萄糖、D-果糖和海藻糖）以及三种脂肪酸（如顺式-11,14,17-二十碳三烯酸（C20-3n3）和γ-亚麻酸（C18-3n6））显著积累，而在LT条件下两种可溶性糖和一种脂肪酸含量下降。总之，低温作为外部信号，与ROS和GA-ABA-IAA共同调控了种子休眠释放和萌发。湿沙微环境也是唤醒文冠果种子胚的关键因素。

低温–活性氧–激素协同调控文冠果种子休眠释放与萌发——论文解读

一、研究背景与科学问题

文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）隶属无患子科（Sapindaceae），是一种落叶木本油料树种，主要分布于中国西北地区的陕西、山西、河北、甘肃、内蒙古、山东等地。其种子含油量高达55–65%，其中93%为不饱和脂肪酸（UFAs），包括约40%油酸、30%亚油酸和5%神经酸。神经酸作为植物油中极为罕见的成分，具有增强免疫力、促进婴幼儿大脑发育、治疗癌症和肿瘤以及缓解阿尔茨海默病等功效，使文冠果种子油在医药保健品、食用油、化妆品及生物燃料等领域具有多重工业价值。此外，文冠果树具有耐寒、耐旱、耐贫瘠和耐盐碱的特性，被全球公认为具有重要经济和药用价值的物种。

林木种子质量是决定育种效率、品种改良和遗传资源保护的关键因素之一。然而，文冠果种子具有休眠特性，自然萌发率仅为6–20%，严重制约了苗木培育和新品种的开发推广。种子休眠是一个复杂的生理生化过程，即使在条件适宜的情况下也能阻止种子萌发。已有研究表明，种子休眠主要由五类因素引起：环境因素（温度、水分、氧气、光照等）、种皮障碍（种皮过厚、存在抑制物质等）、生理后熟问题（大量淀粉和脂肪等贮藏物质积累）、萌发抑制物质（如脱落酸（ABA））的存在、胚发育不完全，以及上述因素组合形成的复合休眠。

在调控种子休眠与萌发的内部因子中，赤霉素（GA）、生长素（AUX）、细胞分裂素（CTK）、ABA、乙烯（ET）和茉莉酸（JA）等激素起关键作用。其中ABA在维持种子休眠中占主导地位，而GA通过拮抗ABA介导的信号传导并激活生理过程来促进休眠释放。活性氧（ROS）如超氧阴离子（O₂^•?）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（•OH）现已被认为是种子休眠的必要调节因子，但过量ROS会造成氧化损伤并抑制萌发，种子萌发需要ROS处于“氧化窗口”水平。温度是影响种子萌发最重要的环境因子之一，低温贮藏可打破种子休眠并提高萌发率。尽管已有研究证实?20 °C低温贮藏能显著提高文冠果种子萌发率，但低温打破文冠果种子休眠的生理和分子机制尚不清楚。因此，开展本研究对于阐明文冠果种子休眠释放机制、培育优良品种具有重要的理论和实践意义。

二、研究内容与主要结论

研究人员以文冠果种子为材料，将其在?20 °C（LT）和25 °C室温（RT）条件下贮藏60天，系统研究了低温贮藏对种子萌发、超微结构、吸水特性、相对电导率（REC）、抗氧化酶活性、激素水平以及糖和脂肪酸代谢的影响。主要结论如下：LT贮藏后种子萌发率达47.3%，显著高于RT条件下的32.7%；在四种萌发方法中，直接湿沙萌发（GMS）最为有效。VI期（贮藏后）和VII期（萌发第7天）是打破休眠和触发萌发的关键阶段。LT贮藏保持了种壳和种仁的高完整性，特别是种仁；SOD、CAT和POD活性以及IAA、IPA水平和IAA/ABA、tHor/ABA比值均较高，其中VII期tHor/ABA比值增加62.7%，ABA下降23.2%。LT处理促进了淀粉和脂肪降解，显著积累了八种可溶性糖和三种脂肪酸。研究揭示低温作为外部信号，与ROS和GA-ABA-IAA共同调控种子休眠释放和萌发，湿沙微环境是唤醒胚的关键因素。该论文发表在《Plants》期刊。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：种子萌发试验（设置GMS、35 °C + GMS、ABT + GMS和PEG + GMS四种处理）；扫描电子显微镜（SEM）观察种壳和种仁超微结构；生理指标测定（吸水率、含水量、相对电导率REC、SOD/POD/CAT活性、H₂O₂和丙二醛（MDA）含量）；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IAA、GA₃、ZR、IPA和ABA五种内源激素；靶向代谢组学分析（气相色谱-质谱联用（GC-MS））检测糖和脂肪酸代谢物；主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和KEGG通路富集分析。种子材料来源于山东沃奇农业发展有限公司文冠果种质资源圃（中国潍坊），于11月采集。

四、研究结果

4.1 低温贮藏对种子萌发的影响

在四种萌发处理中，GMS处理的累积萌发频率、萌发率、萌发势和萌发指数在LT或RT贮藏条件下均最高，而ABT处理效果最差。GMS和35 °C + GMS处理最早萌发，种子从第1或第2天开始萌发；ABT + GMS和5% PEG + GMS处理从第7天才开始萌发。LT贮藏的所有指标均显著高于RT贮藏，LT条件下萌发率（47.3%）高于RT条件（32.7%）。因此，?20 °C冷冻贮藏结合直接湿沙萌发是文冠果种子萌发的有效方法。

4.2 低温贮藏对种子超微结构的影响

SEM观察显示，LT贮藏后种壳饱满、光滑、紧密，间隙少，种仁表面光滑，内部结构完整，表明低温贮藏能有效保持种壳和种仁的完整性，减少水分流失和损伤。而RT贮藏60天后，种壳表面明显皱缩、布满细裂纹，侧面出现间隙，种仁外表面和内表面粗糙且有明显裂纹，表明室温贮藏对种壳和种仁造成了损伤。萌发第7天，LT条件下种壳表面略粗糙但无裂纹，种仁虽有粗糙、凸起和凹陷症状但仍相对完整光滑；RT条件下种仁出现裂纹，侧面有大间隙和裂缝，种仁表面和内部呈现明显的脊状条纹，表明损伤严重。

4.3 低温贮藏对种子吸水特性的影响

贮藏结束时（VI期），LT贮藏种子的含水量显著高于RT贮藏。在168小时萌发过程中，两种贮藏条件下的吸水率（WAR）和含水量（MC）均呈上升趋势，呈“S形”曲线。前0–72小时吸水较慢，96–168小时逐渐增加。120小时开始出现差异，144–168小时（萌发第6–7天）差异显著。与RT贮藏相比，LT样品萌发168小时后的WAR和MC分别降低了9.92%和8.95%。

4.4 低温贮藏对种壳和种仁相对电导率的影响

LT贮藏后，种壳和种仁的REC均显著低于RT贮藏。萌发期间，LT条件下种壳REC在0–72小时显著较低，特别是0小时（VI期）、8、24、32和96小时，LT样品在32小时和96小时的REC值分别比RT样品低21.5%和12.8%。种仁REC趋势与种壳相似，LT组在整个7天萌发期均低于RT组，0–32小时、96小时和144小时差异显著，0小时和24小时差异最大，LT处理分别比RT处理降低了35.6%和43.6%。168小时两组间无显著差异。

4.5 低温贮藏对种子抗氧化指标的影响

LT处理种子的SOD活性在整个萌发期均高于RT处理，但仅在0天（VI期）差异显著，LT处理比RT处理高17.4%。POD活性变化大于SOD，在0–21天萌发期间LT样品显著高于RT样品，VII期差异最大，LT处理比RT处理增加41.9%。CAT活性变化与SOD相似，仅在VI和VII期差异显著，分别比RT处理增加14.2%和27.8%。RT贮藏种子的H₂O₂含量在VI至V期显著高于LT种子，VI–VII期H₂O₂含量比LT处理高87.0%和97.4%。RT条件下MDA水平在VI–V期均高于LT条件，VII期差异最显著，RT组MDA水平比LT条件高148.1%，表明萌发第7天膜损伤最严重，LT贮藏可减少膜损伤。

4.6 低温贮藏和萌发过程中激素水平的变化

整个萌发期间，IAA、IPA、GA、IAA/ABA和tHor/ABA水平稳步上升，ABA呈下降趋势。LT处理后，IAA和IPA水平在VI、VII和V期均显著高于RT贮藏，IAA分别高35.1%、46.2%和23.7%，IPA分别高28.9%、29.2%和11.8%，IAA/ABA分别高34.9%、90.5%和16.4%。ZR在VI和V期分别增加13.3%和17.6%。与IAA不同，LT处理在VI和V期GA₃水平分别比RT处理略降6.0%和12.9%；ABA水平在RT贮藏后（VI期）保持不变，但VII期LT处理ABA水平比RT处理显著降低23.2%。GA₃/ABA比值在VI期无显著差异，VII期增加24.5%，V期降低17.7%。然而，tHor/ABA比值在VI、VII和V期LT贮藏种子均显著高于RT，分别增加16.3%、62.7%和7.4%。

4.7 种子萌发过程中糖和脂肪酸的代谢组学分析

靶向代谢组学分析检测到24种糖代谢物，其中10种存在显著差异：8种上调（麦芽糖、海藻糖、L-岩藻糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、葡萄糖和D-果糖），2种下调（D-半乳糖醛酸和棉子糖）。LT处理中蔗糖含量最高，达28.21 mg/g FW，比RT处理增加41.2%；葡萄糖和果糖含量分别为1.54 mg/g和1.00 mg/g FW，分别是RT处理的28.14倍和60.77倍。检测到34种脂肪酸代谢物，4种存在显著差异：3种上调（辛酸（C8-0）、顺式-11,14,17-二十碳三烯酸（C20-3n3）和γ-亚麻酸（C18-3n6）），1种下调（十九烷酸（C19-0））。LT处理下硬脂酸（C18-0）含量最高，为177.21 μg/g FW，是RT处理的1.95倍；C18-3n6和C20-3n3含量分别为15.98 μg/g FW和1.15 μg/g FW，比RT处理增加1.25倍和5.32倍；C19-0含量比RT处理降低91.7%。KEGG富集分析显示，糖代谢物主要富集在氨基糖和核苷酸糖代谢（ko00520）、ABC转运蛋白（ko02010）、果糖和甘露糖代谢（ko00051）、核苷生物合成（ko01250）以及淀粉和蔗糖代谢（ko00500）通路；脂肪酸代谢物主要富集在亚油酸代谢（ko00591）、辅因子生物合成（ko01240）、硫辛酸代谢（ko00785）、不饱和脂肪酸生物合成（ko01040）和脂肪酸生物合成（ko00061）通路。

4.8 脂肪酸、糖代谢物与生理指标的相关性分析

Pearson相关性分析显示，VI期H₂O₂、MDA和REC与SOD、POD、IAA、ZR、ABA和tHor/ABA六项指标呈极显著负相关；SOD与IAA、POD与tHor/ABA或IAA、CAT与ABA、IAA与tHor/ABA/ABA/ZR、ZR与IAA之间呈极显著正相关。VII期H₂O₂、MDA、REC和C19-0与C18-3n6、C8-0、C20-3n3、海藻糖、L-岩藻糖、ACED-G、麦芽糖、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、ABA、tHor/ABA、IAA、POD和CAT呈极显著或显著负相关；POD和CAT与C8-0、D-木糖、海藻糖、L-岩藻糖、ACED-G、麦芽糖、葡萄糖、D-果糖、tHor/ABA和IAA呈极显著或显著正相关。

五、讨论与结论

研究表明，RT贮藏导致文冠果种壳和种仁受损，受损的种仁导致吸水过多和H₂O₂积累，萌发期间保护酶活性下降，种子无法维持萌发所需的适宜ROS水平，同时高ABA水平使休眠难以打破，导致种子劣变加速和萌发率低。相反，LT贮藏保持了种壳和种仁的高完整性，特别是种仁，可维持高保护酶活性，降低ABA含量，提高tHor/ABA和IAA/ABA比值及IAA水平，使ROS保持在信号转导水平，促进ROS?GA?ABA?IAA信号通路的交叉对话，有利于协调调控种仁唤醒过程，使种子逐渐脱离休眠并达到萌发准备状态。湿沙萌发（GMS）创造了适宜的微环境，淀粉分解为可溶性糖、脂质分解为脂肪酸，脂肪酸再转化为可溶性糖，为种子发育提供能量和碳骨架，刺激旺盛的种子代谢，提高萌发率。

研究结论：种子在?20 °C（LT）贮藏60天后萌发率达47.3%，而室温（25 °C）下仅为32.7%，直接湿沙萌发（GMS）在四种萌发方法中最有效。VI期（贮藏后）和VII期（萌发第7天）是文冠果休眠释放和萌发的关键阶段。VI期SEM显示种壳和种仁具有高完整性，特别是种仁；SOD、CAT和POD活性以及IAA、IPA和tHor/ABA水平较高，这些代谢水平确保种子达到休眠释放的最佳状态。VII期最佳萌发条件（GMS）创造适宜微环境，维持较高的SOD、CAT和POD水平，使ROS保持在信号水平；同时IAA、IPA、IAA/ABA和tHor/ABA（增加62.7%）维持较高水平，ABA比RT处理降低23.2%，促进种子萌发。低温处理促进种子中淀粉和脂肪降解，显著积累八种可溶性糖（如葡萄糖、D-果糖、阿洛酮糖和L-岩藻糖）和三种脂肪酸（辛酸（C8-0）、顺式-11,14,17-二十碳三烯酸（C20-3n3）和γ-亚麻酸（C18-3n6）），两种可溶性糖和一种脂肪酸下调。研究结果表明，低温作为外部信号，与ROS和GA-ABA-IAA共同调控文冠果种子休眠释放和萌发，湿沙微环境也是唤醒文冠果种子胚的关键因素。