《Plants》：Research Progress and Prospects of Molecular Marker Technology on Jujube Trees
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枣树(Ziziphus jujuba Mill.)是一种重要的果树，也是原产于中国的五大经济林树种之一，具有很高的营养和药用价值。它在山区、沙地、盐碱地和干旱区等边际土地资源的高效利用以及乡村产业振兴中发挥着关键支撑作用。分子标记技术凭借其稳定、准确、高效的优
枣树(Ziziphus jujuba Mill.)是一种重要的果树，也是原产于中国的五大经济林树种之一，具有很高的营养和药用价值。它在山区、沙地、盐碱地和干旱区等边际土地资源的高效利用以及乡村产业振兴中发挥着关键支撑作用。分子标记技术凭借其稳定、准确、高效的优势，已成为枣树遗传育种研究的重要工具并得到广泛应用。本文基于三代技术迭代体系对分子标记进行了归纳总结：第一代基于杂交的标记(限制性片段长度多态性，Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、第二代基于PCR的标记(以简单序列重复，Simple Sequence Repeat, SSR为代表)以及第三代高通量测序标记(单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphism, SNP；基因分型测序，Genotyping-by-Sequencing, GBS等)。构建了基于技术原理、多态性来源等多维度的系统分类体系，以清晰阐释枣树研究中分子标记系统演化的驱动力与发展趋势，并明确分子标记的选择标准与适应策略。研究发现，第二代分子标记SSR是枣树种质资源标准化鉴定和低预算群体遗传分析的基础核心工具。以SNP和InDel为代表的第三代分子标记是高密度图谱、全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study, GWAS)、基因组选择(Genomic selection, GS)等现代精准育种的核心载体，形成了层次互补的技术体系，并逐渐成为研究主流。本文总结了分子标记在枣树种质资源精准鉴定、遗传多样性分析、亲缘关系确定、高密度遗传图谱构建、全基因组关联分析、功能基因定位以及驯化与演化追溯等方面的应用进展。本文以“技术缺陷驱动的标记迭代”这一统一科学框架整合所有现有研究，分析了不同标记系统演化与替代的内在逻辑、早期标记的固有局限性、当前研究中存在的问题，并探讨了未来研究方向，旨在为枣树中分子标记的科学高效应用提供参考，并促进枣树分子标记辅助育种技术体系的完善与升级。
本文系统综述了枣树分子标记技术的分类体系、技术特征、选择策略及其在枣树遗传育种研究中的应用进展。文章首先论述了枣树的经济生态价值与分子标记技术的发展历程，指出枣树分子标记研究始于第二代PCR标记，第三代高通量测序标记正成为主流。进而从技术原理、多态性来源、遗传特性、功能相关性等维度构建了分子标记分类系统，比较了RFLP、SSR、SNP、InDel、RAD、GBS等标记的技术特点与适用场景。在应用层面，文章分别总结了第二代标记(SSR、AFLP、ISSR等)和第三代标记(SNP、InDel等)在种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建、重要农艺性状基因定位、全基因组关联分析以及驯化演化研究中的具体进展。文章分析了当前枣树分子标记研究中存在的功能标记开发不足、高通量检测体系缺乏、育种应用转化脱节、数据孤岛与标准化缺失、多组学与新兴技术融合不够等问题，并提出了功能标记开发与高通量基因分型平台建设、全基因组选择育种体系构建、资源共享与标准制定、新兴技术整合、产学研协同以及多标记联合应用等未来发展方向。文章认为，SSR与SNP标记呈层次互补关系而非替代关系，SSR仍适用于种质资源初筛和低成本鉴定，SNP/InDel则是高密度遗传分析和精准育种的核心载体。未来应加快功能标记开发、构建标准化SNP芯片和KASP标记体系，推进全基因组选择育种实践，并融合泛基因组、基因编辑、表观遗传学与人工智能等技术，以实现枣树从传统表型选择向分子设计育种的跨越。
1. 引言
1.1 枣树的价值与研究意义
枣树(Ziziphus jujuba Mill.)属鼠李科(Rhamnaceae)枣属，由野生酸枣(Ziziphus acerba)演化而来，是中国特有的重要经济果树和五大经济林树种之一，具有抗旱、耐盐碱、耐贫瘠等优良生物学特性，在边际土地利用和乡村产业振兴中具有重要价值。枣果营养丰富，兼具药用功效，开展枣树遗传育种研究对产业高质量发展意义重大。
1.2 分子标记技术的发展与研究应用
分子标记是基于DNA水平遗传变异的多态性标记，具有不受环境、样本类型和采样时期影响的特点，具备稳定性高、准确性高、检测快速等优势。分子育种包括标记辅助选择(MAS)和基因组选择(GS)等技术分支。分子标记技术历经三代发展：第一代以RFLP为代表，基于Southern杂交；第二代以SSR、AFLP、ISSR为代表，基于PCR扩增；第三代以SNP、InDel、RAD、GBS为代表，基于高通量测序。
1.3 枣树分子标记研究进展与现状
枣树分子标记研究起步较晚，第一代标记未见应用报道。1992年本团队率先利用RAPD标记鉴定金丝小枣和无核枣变异类型，开启了枣树分子标记研究。随后SSR、ISSR等标记在品种鉴定和遗传分析中得到应用。基于高通量测序的SNP和RAD标记在本团队枣树全基因组测序中用于构建高密度遗传图谱。当前SSR仍是常用标记，SNP和InDel正逐渐成为主流。T2T单倍型基因组和泛基因组资源的发布为枣树分子标记研究提供了新基础，PAV、CNV、SV等结构变异逐渐受到重视。
2. 分子标记的分类、特征与选择策略
2.1 分子标记分类体系
按技术原理分为三代：第一代RFLP标记具有共显性、高稳定性但操作复杂；第二代包括基于随机引物PCR的RAPD和ISSR，基于特异性引物PCR的SSR、STS、SCAR，以及结合PCR和酶切的AFLP；第三代基于高通量测序，包括SNP、InDel、RAD、GBS及芯片KASP标记，具有高通量、高精度优势。
按多态性来源分为四类：限制性片段长度差异标记、重复序列长度差异标记、单核苷酸碱基变异标记和短片片段插入缺失标记。
按遗传特性分为显性标记(RAPD、AFLP)和共显性标记(RFLP、SSR、SNP)。
按功能性分为中性标记和功能标记。功能标记包括基因来源的SSR、EST-SSR、CAPS、dCAPS和功能性SNP等。KASP并非独立标记类型，而是高通量基因分型检测平台。
2.2 常用分子标记技术特征比较
SSR标记多态性高、成本适中，但引物设计耗时且物种特异性强；SNP标记检测通量高、单位数据成本低，但初期设备投入较大。基于枣树基因组高杂合、小基因组的特点，SSR适用于早期种质评价，SNP/GBS更具自动化高通量优势，更适合GWAS和GS。两者无替代关系，建议采用层次组合策略。
2.3 分子标记选择依据与适应策略
2.3.1 分子标记选择依据
需综合考虑研究目的、标记技术特征、研究物种特性以及技术可行性与经济成本四方面因素。
2.3.2 分子标记适应选择策略
遗传多样性分析优先选用高多态性标记；品种鉴定推荐SSR；遗传图谱和QTL分析需高密度共显性标记；标记辅助育种选择与目标性状紧密连锁的标记；功能基因挖掘选用EST和SNP。物种基因组特征和实验条件也决定标记选择，候选标记需进行预实验验证。
2.3.3 多年生果树分子标记选择横向比较
葡萄SSR标记开发最早并建立国际标准，苹果、桃已完成商业化高密度SNP芯片和KASP功能标记体系。枣树与主流果树存在差距：尚无标准化商业SNP芯片，三倍体种质比例高且缺乏适合的SNP分型算法，未建立大规模基因组选择体系。可借鉴桃和苹果的成熟技术路径。
3. 分子标记技术在枣树中的应用进展
3.1 第二代分子标记在枣树研究中的应用
第二代标记的应用开启了枣树分子标记研究，SSR成为核心标记。
3.1.1 种质资源鉴定与亲缘关系分析
RAPD标记早期用于初级区分品种，但因可重复性差已基本退出。AFLP和ISSR用于区域性种质鉴别，但缺乏通用标准化引物。SSR标记解决了重复性差的缺点，广泛用于枣品种鉴定和亲缘关系分析，如利用SSR结合流式细胞术鉴定杂交后代倍性、区分249份枣基因型、分析栽培枣与野生酸枣的亲缘关系等。但SSR标记全基因组覆盖密度极低，难以支持复杂数量性状精确定位。
3.1.2 遗传多样性分析与核心种质构建
SSR、AFLP、ISSR是枣树遗传多样性评价的主要标记。SSR分析精度显著高于显性标记，被用于构建包含150份核心种质的种质库。AFLP和ISSR多用于区域性小规模种质评估。不同研究使用SSR引物不一致，导致数据横向比较困难。
3.1.3 早期遗传图谱初步构建
第二代标记仅能构建低密度连锁图谱，标记间隔大、饱和度不足，只能粗略定位主效基因，作为第三代高密度图谱的基础。
3.2 第三代分子标记在枣树研究中的应用
3.2.1 高密度遗传连锁图谱构建与优化
基于RAD、GBS和全基因组重测序的SNP/InDel标记已成为构建枣树高密度遗传图谱的核心技术。现有图谱平均标记间隔已缩小至0.2 cm。但该技术依赖高质量T2T参考基因组，且三倍体枣树SNP分型算法尚不成熟。
3.2.2 重要农艺性状基因定位与挖掘
GWAS结合SNP标记已定位到多个与抗旱、果实品质、驯化性状关联的位点。QTL-seq技术被用于果实大小候选基因筛选。但现有GWAS体系存在检测微效位点能力不足、统计模型单一、缺乏系统群体结构校正、多为单环境单性状分析等问题。多组学联合分析(GWAS+RNA-seq+eQTL+代谢组+蛋白质组)在枣树领域应用案例较少，标准化候选基因挖掘流程尚未形成。
3.2.3 枣树驯化与演化研究
基于SNP等标记的研究证实栽培枣由野生酸枣驯化而来，且存在自然选择和人工驯化两条路径。InDel标记用于野生酸枣与栽培枣的亲缘关系分析。SNP标记应用于美国枣资源遗传多样性分析和巴基斯坦野生枣群体遗传评价。当前研究仅关注SNP单碱基变异，泛基因组挖掘的PAV、CNV、大片段SV尚待开发为分子标记。
3.3 不同分子标记技术在枣树中应用效果比较
第二代SSR标记为枣树研究的“基础核心标记”，第三代SNP和InDel标记为“发展核心标记”，二者呈现互补协作关系而非替代关系。实际研究中可先用SSR进行种质初筛，再用SNP进行高密度基因定位。
4. 枣树分子标记研究存在的问题与挑战
4.1 分子标记开发与测序技术固有缺陷
功能分子标记开发严重不足；缺乏基于T2T单倍型基因组的高通量检测体系，SNP芯片和KASP标记开发处于空白；高通量测序固有误差(如T2T基因组局部重复区组装间隙、GBS低深度测序导致缺失基因型、PCR扩增偏好、三倍体SNP分型算法缺失)影响标记可靠性；PAV、CNV和SV等结构变异尚未转化为可育种种标记。
4.2 分子标记与育种实践转化脱节
多数分子标记研究停留在基础研究层面，未与传统育种技术有机融合，基因组辅助选择育种体系尚未完整建立，育种仍依赖传统表型选择。
4.3 数据孤岛与标准化体系缺失
不同团队开发的标记缺乏统一数据库管理，标记序列、分型流程和研究结果难以跨项目整合比较，造成资源浪费并阻碍标准化发展。
4.4 新兴多组学与交叉学科技术融合不足
基因编辑、泛基因组学、人工智能和单细胞测序技术在枣树分子标记开发中的应用仍显不足，未充分发挥其在功能验证、变异全景分析和组织特异标记开发方面的协同效应。
5. 枣树分子标记研究未来发展方向与对策
5.1 功能标记开发与高通量基因分型平台
基于460份枣树种质的重测序数据，已鉴定出585131个高质量SNP并开发出100个核心KASP标记，其中23个成功转化为功能KASP标记。围绕ZjAC03基因启动子开发的SNP标记与果实柠檬酸含量显著关联。未来应利用T2T单倍型基因组加速开发单倍型标记和标准化SNP芯片，提出具体目标：构建含3000～5000个均匀分布功能位点的SNP芯片；筛选不少于200个与果实品质、抗旱、抗病相关的KASP功能标记；实现单样本100元以内成本控制和每批384份样品检测；建立“泛基因组变异挖掘→RNA-seq/eQTL筛选候选基因→独立群体标记验证”的标准化流程。
5.2 全基因组辅助选择育种体系构建
以分子标记技术为核心，整合功能基因挖掘成果，构建涵盖种质鉴定、性状定位和分子选择的枣树全基因组辅助选择育种体系。MAS和MABC在部分育种项目中已有初步应用，但基因组选择和基因组预测仍主要限于基础研究，主要瓶颈为训练群体规模不足和缺乏成熟高密度标记组合。应基于现有460份种质重测序数据构建基因组选择育种值预测模型，将分子基因分型纳入育种全流程。
5.3 分子标记资源共享与技术标准完善
应加强国内外团队合作，构建统一的枣树分子标记数据库，打破数据孤岛，并制定国家和国际层面的枣树分子标记开发、验证、检测和应用技术规范，确保不同平台和实验室数据的可比性。已建立的460份种质核心收集品和DNA指纹图谱系统及二维码识别系统可为此类标准化工作提供基础资源。
5.4 新兴技术融合
利用人工智能和深度学习优化GWAS统计模型；利用CRISPR/Cas9验证候选基因功能并为功能标记开发提供靶点；利用泛基因组挖掘PAV、CNV和SV并开发结构变异标记；利用单细胞测序挖掘果肉、叶片、花等组织特异性变异标记。
5.5 产学研协同与专利保护
推动高校、科研院所与育种企业深度合作，共建枣树分子标记育种中心，促进功能标记的产业转化，并加强原创性、低成本、高价值分子标记的专利保护。
5.6 分子标记技术系统化协同应用
从单一标记应用模式转向多标记组合应用，如SSR+SNP组合用于种质资源评价，SNP+InDel组合用于基因定位。进一步探索分子标记与基因编辑的集成应用，实现精准分子设计育种。
6. 总结与展望
枣树分子标记研究虽起步较晚但发展迅速。第二代标记中SSR仍是种质鉴定和多样性分析的基础核心标记；第三代标记以SNP和InDel为中心，正逐渐成为高密度遗传图谱、重要基因定位和驯化演化研究的主流。两者呈互补协作关系。当前主要挑战包括功能标记开发不足、高通量检测系统缺乏、与育种实践结合不紧密、数据共享机制不完善和新兴技术融合不够。未来应重点发展功能标记和高通量检测平台，建立全基因组辅助选择育种体系，完善共享机制和标准，促进多组学与基因编辑、人工智能、泛基因组学等新兴技术的交叉融合。果实形状与裂果的遗传架构、糖积累调控网络、驯化相关全基因组变异等问题仍有待深入研究，需扩展GWAS群体、整合多组学、构建图泛基因组，并利用CRISPR/Cas9进行功能验证。表观遗传学特别是DNA甲基化已在枣树果实发育和驯化研究中显示出作用，未来表观基因组关联分析可能鉴定到与农艺性状相关的甲基化QTL。SSR+SNP组合应用将成为趋势，最终实现从传统表型选择到精准分子设计育种的跨越，为高产、优质、强适应性枣树新品种的选育提供技术支撑。
