《Cell Reports》：Endothelial PERK restricts lymphoid regeneration by reducing DLL4-NOTCH3 signaling at the Pre-B niche
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摘要翻译：造血干细胞（HSC）移植后免疫恢复延迟与不良临床结局相关。研究人员研究了未折叠蛋白反应（内质网应激）在骨髓（BM）微环境内造血再生中的作用。研究揭示，BM内皮PERK激活是白血病患者的显著特征，也是小鼠接受电离辐射后的标志性反应。敲除内皮Perk可增
摘要翻译：造血干细胞（HSC）移植后免疫恢复延迟与不良临床结局相关。研究人员研究了未折叠蛋白反应（内质网应激）在骨髓（BM）微环境内造血再生中的作用。研究揭示，BM内皮PERK激活是白血病患者的显著特征，也是小鼠接受电离辐射后的标志性反应。敲除内皮Perk可增强NOTCH配体DLL4表达，并促进DLL4依赖的早期HSC和B祖细胞再生。单细胞分析显示，内皮DLL4激活间充质基质细胞表达的NOTCH3，且PERK-DLL4轴协调调控淋巴定向分化。NOTCH3对辐照后IL7上调和淋巴祖细胞扩增至关重要。这些发现不仅揭示了再生造血中内质网应激控制的血管-基质信号传导机制，还强调PERK阻断是改善清髓性移植后免疫恢复的一种有前景的策略。
论文解读：
造血干细胞移植后免疫恢复延迟是影响临床预后的重要因素，尤其在清髓性预处理后，淋巴细胞再生缓慢会增加感染和复发风险。骨髓微环境中的内皮细胞和间充质基质细胞通过提供造血生长因子和支持性信号维持造血稳态与再生，然而在放化疗造成的应激条件下，这些基质组分如何适应并调控淋巴细胞再生的机制尚不清楚。内质网应激反应中的PERK通路是真核细胞应对蛋白折叠负荷增加的关键适应性机制，但其在骨髓微环境中的功能尤其是在内皮细胞中的角色长期未被充分认识。研究人员基于此前发现内皮PERK参与NOTCH配体表达调控和白血病相关血管重塑的线索，系统探究了内皮PERK在清髓后造血再生中的功能，试图阐明内质网应激信号如何通过血管-基质相互作用影响淋巴细胞谱系的恢复。
研究人员首先在致死性辐照和移植模型中观察到骨髓内皮细胞而非间充质基质细胞呈现显著的PERK磷酸化激活，提示内皮PERK可能特异性调控应激下的造血重建。通过构建内皮特异性Perk敲除小鼠，研究人员发现Perk缺失在稳态下不影响造血，但在移植或5-FU化疗后能显著加速白细胞尤其是B淋巴细胞的恢复，并增加HSC、CLP及B系祖细胞数量。进一步研究表明，PERK缺失导致内皮DLL4蛋白稳定性增加而非转录上调，从而提升细胞表面DLL4水平。在DLL4抗体阻断实验和内皮Dll4单敲除以及Perk/Dll4双敲除小鼠模型中，研究人员证明DLL4是Perk下游的关键效应分子，其上调介导了Perk缺失带来的促淋巴再生作用。
在血管生物学层面，研究人员通过共聚焦成像和活体双光子显微镜观察发现，DLL4缺失导致辐照后骨髓血管异常扩张、结构紊乱且通透性增加，而Perk缺失则因DLL4升高而呈现更为有序的血管网络和更好的屏障完整性，表明PERK-DLL4轴在辐照后血管稳态维持中具有重要功能。值得注意的是，DLL4还通过维持HSC静息状态来保护长期再生能力；竞争性二次和三次移植实验显示，在Dll4缺失环境中预处理的供者HSC重建造血能力显著降低，细胞周期分析也证实DLL4缺失使HSC加速进入细胞周期、G0期比例下降。
单细胞RNA测序分析揭示了PERK-DLL4轴调控淋巴再生的精细分子网络。在基质细胞组分中，研究人员鉴定出CAR细胞为表达CXCL12和SCF的关键龛细胞亚群，并发现Perk缺失增强CAR细胞中IL7的表达，而Dll4缺失则显著抑制IL7。细胞通讯分析显示Perk缺失强化了CAR细胞IL7与淋巴祖细胞IL7R之间的信号交流。此外，Perk缺失还诱导了以Irf7、Irf1和Stat1为核心的干扰素应答程序，该程序在DLL4缺失时消失，表明DLL4依赖的干扰素信号参与协调再生微环境。通过SCENIC转录因子调控网络分析和CellChat配体受体互作分析，研究人员锁定NOTCH3为CAR细胞中与内皮DLL4配对的主要NOTCH受体。
功能验证实验证实了这一发现：Notch3基因敲除小鼠在稳态下造血基本正常，但在接受移植后表现出B细胞恢复延迟以及MPP4、CLP和B祖细胞再生受损。体外实验显示，Notch3缺失的骨髓基质细胞在辐照后IL7上调能力减弱，其形成的间充质球支持淋巴祖细胞扩增的能力也下降约25%，而CXCL12表达不受影响。这些结果共同表明，内皮DLL4通过激活CAR细胞上的NOTCH3来促进辐照后IL7的产生和淋巴定向分化。相比之下，内皮Jag1缺失对辐照后HSPC恢复和血管再生无明显影响，进一步支持DLL4-NOTCH3轴的专一性。
综上所述，该项研究确立了内皮PERK-DLL4轴与CAR细胞NOTCH3构成的血管-基质信号回路是清髓后淋巴再生的核心调控机制。PERK激活作为内质网应激的标志在白血病患者骨髓内皮中显著升高且与DLL4下调相关，这与动物模型中的发现高度一致。研究人员还验证了药理学PERK抑制剂GSK2656157能在移植后促进B细胞恢复，提示PERK阻断具有临床转化潜力。该研究将内皮内质网应激、血管-基质NOTCH信号、干扰素应答和IL7产生有机联系起来，为理解再生造血的微环境调控提供了新视角，也为改善清髓性移植后免疫重建提供了以PERK为靶点的治疗策略。
主要技术方法：研究人员构建了内皮特异性诱导型基因敲除小鼠模型（VE-cadherinERT2-Cre介导的Perk、Dll4及Perk/Dll4双敲除），使用流式细胞术分析HSPC亚群和基质细胞；采用单细胞RNA测序结合Harmony整合、CellChat细胞通讯分析、SCENIC转录因子活性推断和GSEA通路分析解析骨髓细胞图谱；通过全组织免疫荧光染色和活体双光子显微镜评估血管形态与通透性；使用竞争性二次及三次骨髓移植实验检测HSC长期重建能力；利用间充质球与造血祖细胞共培养体系评估基质细胞支持淋巴分化的功能；同时使用PERK抑制剂GSK2656157和DLL4阻断抗体进行药理学验证，并纳入急性髓系白血病患者骨髓标本进行免疫组织化学分析。
结果部分：
Perk敲除促进早期HSC和淋巴再生：通过内皮特异性Perk敲除小鼠模型，研究人员发现Perk缺失在移植和5-FU化疗后显著加速白细胞和B淋巴细胞恢复，增加HSC、CLP及B祖细胞数量，且不影响长期造血。
DLL4缺失抵消Perk敲除的促再生效应：DLL4阻断抗体或内皮Dll4敲除均逆转了Perk缺失带来的HSC和B祖细胞增加，DKO小鼠呈现B细胞减少和粒细胞增多表型，证明DLL4位于Perk下游发挥作用。
PERK-DLL4调控辐照后血管稳态：Dll4缺失导致辐照后骨髓血管异常扩张、结构紊乱和通透性增加，而Perk缺失因DLL4升高而维持了有序的血管构型和屏障功能。
Perk和DLL4差异调控HSC与B祖细胞相关通路：单细胞测序显示Perk缺失上调B祖细胞中免疫应答相关基因并增加Il7-Il7r信号，而Dll4缺失则相反；DLL4还通过维持HSC静息状态保护长期再生能力。
PERK-DLL4轴协调基质网络促进HSC淋巴定向：Perk缺失增强CAR细胞IL7表达及干扰素应答，细胞通讯分析显示CAR细胞IL7与淋巴祖细胞IL7R的强相互作用，SCENIC分析鉴定出Irf7、Irf1和Stat1的转录因子活性上调。
NOTCH3介导DLL4促淋巴再生功能：CAR细胞高表达NOTCH3且与内皮DLL4存在强互作，Notch3敲除小鼠辐照后IL7上调受损、B祖细胞再生下降，间充质球共培养实验证实NOTCH3对基质支持的淋巴扩增至关重要。
讨论与结论：该研究揭示了内皮PERK-DLL4轴与CAR细胞NOTCH3构成的“前B细胞龛”调控网络，将内皮内质网应激与血管-基质NOTCH信号、干扰素应答和IL7产生相联系，不仅阐明了淋巴再生的新型微环境调控机制，还提出PERK抑制可作为改善清髓性移植后免疫恢复的潜在治疗策略。局限性在于双敲除模型难以单独评估DLL4升高的净效应，且PERK调控DLL4蛋白降解的精确分子机制尚待深入阐明。
