《Biology》：1,2-Dichloroethane Induces Neuronal Apoptosis Through AMPK-mTOR-ULK1 Pathway Activation and Autophagic Flux Impairment
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长期暴露于1,2-二氯乙烷（1,2-DCE）可导致认知功能障碍，而神经元丢失已被证实是关键驱动因素。在小鼠中，1,2-DCE暴露降低了海马三磷酸腺苷（ATP）水平，触发AMP活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制及Unc-51样
长期暴露于1,2-二氯乙烷（1,2-DCE）可导致认知功能障碍，而神经元丢失已被证实是关键驱动因素。在小鼠中，1,2-DCE暴露降低了海马三磷酸腺苷（ATP）水平，触发AMP活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制及Unc-51样激酶1（ULK1）激活，同时Beclin 1和微管相关蛋白1轻链3-II/I（LC3-II/I）水平升高，共同表明自噬启动增强。与此同时，p62积累及溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）和组织蛋白酶D（CTSD）表达降低表明自噬降解受损，并伴随神经元凋亡增加。与这些体内研究结果一致，PC12细胞（一种神经元样细胞系）在暴露于2-氯乙醇（2-CE，1,2-DCE在体内的代谢产物）后表现出线粒体功能障碍，表现为ATP耗竭、线粒体膜电位丧失及活性氧（ROS）产生增加。此外，2-CE激活AMPK-mTOR-ULK1信号通路以启动自噬，同时破坏溶酶体结构和功能，导致自噬流受损和凋亡增强。总之，长期1,2-DCE暴露诱导线粒体功能障碍和ATP耗竭，激活AMPK-mTOR-ULK1介导的自噬启动；同时伴随的溶酶体损伤损害自噬降解，二者共同作用促进神经元凋亡。这些发现为预防和治疗1,2-DCE诱导的认知障碍提供了潜在策略。
一、研究背景与意义
1,2-二氯乙烷（1,2-DCE）是一种广泛应用于工业和农业的有机溶剂，是制造氯乙烯单体的关键原料，同时也用作粮食熏蒸剂和土壤灭菌剂。该化合物可通过呼吸道吸入、胃肠道摄入和皮肤接触进入人体，并迅速分布至体循环和外周组织，其中大脑是主要靶器官。1,2-DCE经细胞色素P450 2E1（CYP2E1）代谢转化为2-氯乙醇（2-CE），这是一种高反应活性且毒性更强的中间代谢物，可诱导脑组织损伤。流行病学研究一致表明，长期1,2-DCE暴露可导致人类出现头晕、失眠和记忆力下降等神经系统症状。研究人员前期研究也证实，1,2-DCE暴露可诱发小鼠焦虑样行为和认知功能障碍。尽管已有充分证据确立1,2-DCE的中枢神经系统（CNS）神经毒性，但其潜在分子机制仍不明确，亟待深入研究。
自噬是维持细胞和机体稳态的核心分子通路，通过清除受损线粒体、降解凋亡效应蛋白、清除活性氧（ROS）、提供代谢能量及缓解内质网应激等多种途径发挥细胞保护作用。自噬是一个动态多步骤过程，即自噬流（autophagic flux），涵盖自噬体形成、成熟、与溶酶体融合以及溶酶体水解酶降解包裹物。多种核心蛋白作为自噬活性的关键指标：LC3被脂化为LC3-II并整合至自噬体膜，作为自噬体形成的特异性标志物；p62/SQSTM1与LC3结合并被自噬选择性降解，其积累提示自噬降解受损；Beclin 1是启动自噬体形成的III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）复合物的核心组分。自噬失调可表现为自噬不足和自噬过度激活两种形式，超过阈值的过度自噬或自噬流减少均会损害细胞存活。在神经系统中，神经元是终末分化细胞，不具备增殖能力，自噬的精确稳态调控对神经元存活和生理功能至关重要。然而，自噬在1,2-DCE诱导的神经毒性中的确切作用迄今尚未充分阐明。
AMP活化蛋白激酶（AMPK）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-Unc-51样激酶1（ULK1）轴是调控自噬最经典和核心的信号通路。AMPK作为细胞能量传感器，能量匮乏是其主要激活刺激。在能量充足条件下，细胞内高ATP水平与AMPK的γ调节亚基结合，抑制其激酶活性；反之，能量匮乏时AMP积累可强效激活AMPK。mTOR和ULK1是AMPK在自噬启动中的两个关键下游效应分子。激活的AMPK通过双重调控机制启动自噬：一方面磷酸化并抑制mTOR，解除mTOR对ULK1的抑制；另一方面直接磷酸化ULK1使其激活。研究人员前期工作已验证1,2-DCE暴露可降低小鼠脑组织ATP含量，但AMPK-mTOR-ULK1通路在1,2-DCE神经毒性中自噬激活的调控作用仍属未知。已有证据表明，1,2-DCE暴露可诱导小鼠小脑颗粒细胞（CGCs）和大脑皮层神经元以及人CGCs的凋亡。基于上述背景，本研究旨在验证长期1,2-DCE暴露激活AMPK-mTOR-ULK1信号级联，进而诱导神经元自噬失调和细胞死亡的假说，为阐明1,2-DCE神经毒性的分子机制提供新的见解。
二、主要技术方法
本研究综合运用了多种实验技术。动物实验采用6周龄雌性昆明小鼠，在静态吸入染毒柜中暴露于不同浓度（0、0.225、0.45、0.9 g/m3）的1,2-DCE，每日3.5小时，连续8周，小鼠购自中国医科大学实验动物中心。行为学评估采用新物体识别（NOR）实验和水迷宫（MWM）实验。透射电子显微镜（TEM）用于观察海马CA1区神经元超微结构。体外实验使用PC12细胞（购自中国医学科学院细胞库），以2-CE处理。ATP含量采用化学发光法检测，ROS水平采用DCFH-DA荧光探针检测，线粒体膜电位（MMP）采用JC-1染色检测。自噬流评估采用Ad-RFP-GFP-LC3B腺病毒转染结合激光共聚焦显微镜观察。蛋白表达水平采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测，涉及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3）、自噬标志物（LC3B、Beclin 1、p62）、溶酶体标志物（LAMP1、CTSD）及信号通路蛋白（p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1）。药理学干预使用雷帕霉素（Rapa，自噬激活剂）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，自噬抑制剂）、氯喹（CQ，溶酶体抑制剂）、Compound C（CC，AMPK抑制剂）和海藻糖（trehalose，自噬-溶酶体系统功能增强剂）。统计分析采用GraphPad Prism 9.0软件，组间比较采用单因素和双因素方差分析（ANOVA）及SNK事后检验。
三、研究结果
3.1 1,2-DCE暴露诱导小鼠认知功能障碍和海马神经元凋亡
水迷宫训练阶段，0.9 g/m3 1,2-DCE暴露组小鼠从第3至第5天逃逸潜伏期显著延长；探索实验中，0.45和0.9 g/m3组小鼠目标象限停留时间分别减少41%和52%。新物体识别实验测试阶段，0.45和0.9 g/m3组小鼠对新物体C的识别指数（RI）和辨别指数（DI）显著降低。透射电镜显示1,2-DCE处理组海马CA1神经元出现不同程度的超微结构损伤，包括细胞膜完整性模糊、核形态不规则和线粒体肿胀。海马ATP水平在0.225、0.45和0.9 g/m3组分别下降22%、35%和50%。0.45和0.9 g/m3组Bcl-2/Bax比值显著下调，表明神经元凋亡增强。
3.2 1,2-DCE暴露激活小鼠海马AMPK-mTOR-ULK1通路并损害自噬流
与对照组相比，0.45和0.9 g/m3组LC3-II/I比值、Beclin 1和p62蛋白表达水平显著升高；0.9 g/m3组溶酶体标志物LAMP1表达显著受抑，0.45和0.9 g/m3组CTSD表达显著降低。AMPK、mTOR和ULK1总蛋白水平无明显变化，但0.45和0.9 g/m3组p-AMPK水平上调，0.9 g/m3组p-ULK1水平升高，而p-mTOR表达在0.9 g/m3组显著受抑。这些结果表明1,2-DCE暴露激活AMPK-mTOR-ULK1信号通路，同时损害溶酶体功能，导致自噬流受损。
3.3 2-CE暴露诱导PC12细胞线粒体损伤和凋亡
随着2-CE浓度升高，PC12细胞密度和细胞间连接逐渐减少，90 mM组细胞活力降至约79%。22.5、45和90 mM组ATP水平分别显著下降19%、22%和34%；45和90 mM组ROS水平分别升高25%和33%。JC-1染色显示45和90 mM组红色荧光强度显著降低而绿色荧光强度逐渐增加，表明线粒体膜电位显著去极化。45和90 mM组Bcl-2/Bax比值分别下调38%和46%，证实凋亡增强。
3.4 2-CE暴露诱导PC12细胞AMPK-mTOR-ULK1通路激活和自噬流受损
蛋白免疫印迹结果显示，2-CE处理后p-AMPK和p-ULK1蛋白水平显著上调，45和90 mM组p-mTOR表达显著受抑。45和90 mM组LC3-II/I比值、Beclin 1和p62水平均显著升高。RFP-GFP-LC3B荧光实验显示，Rapa组和90 mM组黄色斑点（自噬体）数量较对照组显著增加，但90 mM组红色斑点（自噬溶酶体）数量较Rapa组显著减少，表明自噬体积累而自噬溶酶体形成受阻。药理学干预实验中，与2-CE单独处理组相比，Rapa联合处理使p62表达降低42%、cleaved caspase-3降低32%、LC3-II/I比值升高48%；而CQ联合处理使p62表达升高37%、LC3-II/I比值升高36%、cleaved caspase-3升高41%。
3.5 3-MA干预减轻2-CE诱导的PC12细胞自噬体积累和凋亡
与2-CE单独处理组相比，3-MA显著降低LC3-II/I比值（41%）、Beclin 1（22%）和p62（24%）水平，同时显著逆转2-CE对LAMP1和CTSD表达的抑制作用。3-MA处理组Bcl-2/Bax比值较2-CE单独组显著升高28%，并显著减轻2-CE对PC12细胞活力的抑制作用。
3.6 海藻糖处理恢复2-CE诱导的PC12细胞自噬流并减少凋亡
海藻糖处理显著下调LC3-II/I比值（30%）和p62表达（26%），同时显著上调LAMP1（80%）和CTSD（78%）水平。海藻糖处理组Bcl-2/Bax比值较2-CE单独组显著升高47%，表明恢复自噬流可减轻细胞凋亡。
3.7 AMPK-mTOR-ULK1信号介导2-CE诱导的PC12细胞自噬及后续凋亡
AMPK特异性抑制剂CC有效阻断2-CE诱导的p-AMPK和p-ULK1上调，同时增加p-mTOR表达。CC处理显著下调LC3-II/I比值、Beclin 1和p62水平，并逆转2-CE对LAMP1和CTSD表达的抑制作用。RFP-GFP-LC3B荧光实验中，CC预处理后绿色荧光部分淬灭，红色斑点数量较2-CE单独组显著增加，表明CC抑制了2-CE触发的过度自噬体积累。CC预处理组Bcl-2/Bax比值较2-CE单独组显著升高。
四、讨论与结论
本研究表明，长期暴露于低剂量1,2-DCE首先导致神经元线粒体功能障碍和ATP耗竭，激活AMPK-mTOR-ULK1信号通路启动自噬；同时，1,2-DCE损害溶酶体结构和功能，导致自噬流受损。这种自噬启动增强与自噬降解受损的双重作用造成自噬体持续积累和溶酶体功能进行性不足，最终触发神经元凋亡。药理学干预实验证实，从上游抑制自噬启动（3-MA和CC）或通过海藻糖恢复溶酶体功能均可部分缓解自噬流受损及其下游凋亡后果。研究首次揭示了1,2-DCE诱导认知障碍的双重机制，即AMPK-mTOR-ULK1介导的自噬过度激活与溶酶体功能障碍导致的自噬流受损协同促进神经元凋亡，为预防和治疗1,2-DCE诱导的认知障碍提供了潜在的新型治疗靶点。该研究也存在一定局限性，包括仅使用雌性小鼠、样本量较小、未采用TUNEL染色定量评估脑组织神经元凋亡、未进行动态自噬流检测、未直接测量溶酶体功能以及未采用体内遗传学或药理学干预等。研究论文发表于《Biology》期刊。
结论：总体而言，研究结果首次表明，长期1,2-DCE暴露诱导神经元线粒体功能障碍和ATP耗竭，并通过AMPK-mTOR-ULK1信号激活自噬启动。伴随的溶酶体损伤导致自噬流受损，这种自噬启动激活与自噬降解受损的联合效应进一步促进神经元凋亡。这些发现为预防和治疗1,2-DCE诱导的认知障碍提供了潜在的新型治疗靶点。
