大豆（Glycine max）OXS3基因家族的全基因组鉴定及GmOXS3-1在碱性胁迫耐受性中的负调控作用

《Agronomy》：Optimizing Nitrogen Application Rates for Organic Bok Choy Production in Subtropical Sandy Soils

　　

氧化胁迫3（OXS3）基因家族编码植物特异性蛋白，在非生物胁迫耐受性和染色质重塑中发挥关键作用。然而，大豆中OXS3基因家族的全基因组鉴定和特征分析尚未系统进行。本研究从大豆基因组中鉴定了19个GmOXS3基因。系统发育分析将这些基因划分为三个亚家族（I–III）。同一亚家族内的成员表现出保守的基序组成。GmOXS3基因的启动子区域包含多种与胁迫和植物激素应答相关的顺式作用调控元件。转录组数据分析显示，GmOXS3基因在不同器官中呈现不同的表达模式。RT-qPCR进一步证实了它们在盐胁迫和碱性胁迫下的差异表达，其中GmOXS3-1和GmOXS3-14在碱性胁迫下观察到最显著的上调。在这些基因中，对GmOXS3-1进行了进一步功能鉴定，发现其在大豆毛状根中负调控碱性耐受性。这些结果为阐明GmOXS3-1介导的碱性胁迫信号传导奠定了基础，并突显了其作为改良碱性耐受性育种靶点的潜力。

大豆GmOXS3基因家族鉴定及其成员GmOXS3-1负调控碱性胁迫耐受性的功能解析

一、研究背景与科学问题

土壤盐碱化是全球范围内限制作物生长和农业生产力的主要环境胁迫因素之一。与中性盐胁迫主要通过Na⁺毒害和渗透失衡造成损伤不同，碱性胁迫因其高pH值及HCO₃^?/CO₃^2?的主导作用而更具破坏性。这种高碱性环境不仅引发离子胁迫和渗透胁迫，还会扰乱根际微环境、干扰细胞内pH稳态，并限制必需微量营养元素的生物有效性，从而对作物造成更严重的伤害。大豆（Glycine max (L.) Merr）是全球重要的植物油和蛋白质来源，但对碱性胁迫高度敏感，其生长发育和产量受到显著抑制。因此，鉴定和功能表征赋予碱性胁迫耐受性的基因，对于遗传改良耐碱性大豆品种具有重要意义。

氧化胁迫3（OXS3）蛋白是一种植物特异性的染色质相关因子，参与非生物胁迫响应和脱落酸（ABA）信号传导。OXS3蛋白最早从芥菜（Brassica juncea）中通过胁迫耐受性的功能筛选被鉴定，其家族成员在N端含有一个保守的N-乙酰转移酶催化结构域（ACD）。尽管OXS3同源物已在拟南芥等多个物种中被系统鉴定，但在栽培大豆中关于OXS3家族的信息仍然有限，且其在碱性胁迫耐受性中的具体作用尚未被专门探讨。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在系统鉴定大豆OXS3基因家族，并重点探究候选成员GmOXS3-1在碱性胁迫响应中的生物学功能。该研究成果发表于《Agronomy》。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   生物信息学鉴定与进化分析：利用隐马尔可夫模型（HMM）从大豆（G. max，Wm82.a6.v1）和拟南芥（A. thaliana，Araport11）基因组中筛选OXS3家族成员，并通过最大似然法（ML）构建系统发育树，采用MCScanX工具进行种内和种间共线性分析。
2. 2.
   基因结构与顺式元件预测：使用MEME在线工具预测保守基序，利用PlantCARE数据库对起始密码子上游2000 bp启动子区域进行顺式作用调控元件预测。
3. 3.
   转录组与基因表达分析：从SoyOmics数据库获取大豆品种中黄13（ZH13）六个器官（根、茎、叶、花、荚、种子）的表达数据（FPKM值）；同时，对大豆品种DN50幼苗进行盐胁迫（200 mM NaCl）和碱性胁迫（50 mM NaHCO₃）处理，采集根和叶片样本，通过RT-qPCR验证七个候选GmOXS3基因的表达变化。
4. 4.
   转基因功能验证：构建GmOXS3-1过表达（OE）和RNA干扰（RNAi）载体，通过发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株K599介导转化大豆毛状根，获得复合植株，并在70 mM NaHCO₃条件下评估碱性胁迫耐受性表型及相关生理指标。

三、研究结果

3.1 大豆GmOXS3家族的鉴定、理化特性及序列保守性

通过HMMER 3.0系统筛选，在大豆基因组中共鉴定出19个非冗余OXS3基因，按染色体顺序命名为GmOXS3-1至GmOXS3-19。理化性质分析显示，预测的多肽长度范围为117至357个氨基酸，分子量介于13.21 kDa至40.76 kDa之间，理论等电点（pI）跨度从4.47到9.51，所有蛋白均呈亲水性且预测定位于细胞核。多序列比对表明，GmOXS3蛋白与拟南芥AtOXS3共享高度保守的ACD结构域，其中六个残基（两个甘氨酸、两个丝氨酸、一个赖氨酸和一个苯丙氨酸）在两个物种中严格保守。

3.2 大豆GmOXS3基因家族的染色体定位与进化分析

19个GmOXS3基因分布于12条大豆染色体上，其中04、06和17号染色体各含有三个成员，14号染色体含有两个，其余八条染色体各含一个。大多数基因位于染色体的远端区域。基于大豆和拟南芥共27个OXS3蛋白全长氨基酸序列构建的最大似然树将所有成员分为三个亚家族（I、II、III）。亚家族I包含3个GmOXS3蛋白和3个AtOXS3蛋白；亚家族II由6个GmOXS3蛋白和2个AtOXS3蛋白组成；亚家族III包含10个GmOXS3蛋白和3个AtOXS3蛋白。值得注意的是，GmOXS3-3和GmOXS3-7在亚家族III内形成一个独立分支。大豆拥有19个成员，而拟南芥仅有8个，表明该家族在大豆中经历了显著扩张。

3.3 大豆GmOXS3基因家族的共线性和进化分析

种内共线性分析揭示了大豆基因组内共26个复制事件，其中包括两个串联重复簇（分别位于04号和06号染色体上的三个连续基因），其余均为片段重复事件，表明染色体间的片段重复是该家族扩张的主要驱动力。大豆与拟南芥的种间共线性分析发现了20个保守的共线性连接，呈现出一对二或多对一的对应关系，提示谱系特异性的全基因组复制（WGD）事件对该家族的扩张做出了重要贡献。

3.4 基因结构和蛋白基序分析

MEME分析在GmOXS3蛋白中预测了10个保守基序（Motif 1–10）。所有成员均含有Motif 1和Motif 2。不同亚家族成员的基序组成存在差异：例如亚家族I缺失Motif 3，亚家族III缺失Motif 5。GmOXS3-3和GmOXS3-7仅含有Motif 1和Motif 2。在基因结构方面，除GmOXS3-4不含内含子外，其余所有成员均含有一个内含子，但内含子长度在不同亚家族间存在变异。这些结构差异暗示了功能分化。

3.5 GmOXS3启动子的顺式元件分析

对19个GmOXS3基因启动子区的分析鉴定出三类主要的顺式作用元件：植物激素响应元件（129个拷贝）最为丰富，其次是胁迫响应元件（61个拷贝）和植物生长发育元件（31个拷贝）。在激素响应元件中，脱落酸响应元件（ABRE）和茉莉酸甲酯响应元件（MeJA-motif）出现频率最高。大部分启动子含有厌氧诱导元件（ARE）和富含TC的重复元件等胁迫响应元件。

3.6 GmOXS3在大豆不同器官中的表达谱

基于转录组数据的表达分析显示，GmOXS3-5、GmOXS3-16、GmOXS3-17和GmOXS3-18在所有检测的营养器官和生殖器官中均表现出普遍较高的转录丰度，其中GmOXS3-17在叶片中表达峰值最高。GmOXS3-12和GmOXS3-19在根和茎中强表达；GmOXS3-1和GmOXS3-10在根和花中强表达；GmOXS3-14在花和种子中富集。GmOXS3-6主要在根中富集。GmOXS3-3和GmOXS3-7则呈现严格的花特异性表达。

3.7 GmOXS3基因在盐胁迫和碱性胁迫下的表达模式

RT-qPCR结果显示，在盐胁迫下，GmOXS3-6、GmOXS3-10和GmOXS3-14在根中显著上调，而在叶片中无显著变化。在碱性胁迫下，所有七个检测的GmOXS3基因在根中均显著上调，其中GmOXS3-1和GmOXS3-14在处理后6小时表现出最大的倍数变化；在叶片中，除GmOXS3-17在6小时显著上调外，其余基因无显著变化。这表明GmOXS3基因在根中对碱性胁迫的响应更为强烈和广泛。

3.8 GmOXS3-1负调控碱性胁迫耐受性

鉴于GmOXS3-1在根中的较高表达水平，研究人员选择其进行深入功能研究。在70 mM NaHCO₃处理5天后，GmOXS3-1-RNAi复合植株的叶片萎蔫程度显著轻于空载体对照（EV），而GmOXS3-1-OE复合植株的萎蔫则加剧。组织化学染色（DAB和NBT）显示，与EV相比，GmOXS3-1-RNAi植株叶片中H₂O₂和O₂^?积累减少，而GmOXS3-1-OE植株中活性氧（ROS）积累显著增加。生理指标测定表明，GmOXS3-1-RNAi植株的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性均显著高于EV，而GmOXS3-1-OE植株的这三种抗氧化酶活性则显著降低。此外，GmOXS3-1-RNAi植株的 shoot含水量（SWC）显著增加，而GmOXS3-1-OE植株的SWC显著下降。这些结果共同证明GmOXS3-1是大豆碱性胁迫耐受性的负调控因子。

四、讨论与结论总结

讨论部分：先前研究表明OXS3蛋白在拟南芥中是ABA和胁迫响应的关键调控因子，但其在大豆碱性胁迫中的作用尚不明确。本研究通过全基因组分析，将GmOXS3-1鉴定为碱性耐受性的负调控因子。大豆OXS3家族包含19个成员，所有蛋白均预测定位于细胞核，且保守的ACD结构域在物种间高度保守。大豆经历的两轮WGD事件是该家族显著扩张的主要原因，其中片段重复和WGD起到了主导作用，为功能多样化提供了遗传冗余。亚家族特异性基序的缺失（如亚家族I缺失Motif 3，亚家族III缺失Motif 5）以及GmOXS3-3和GmOXS3-7简化的基序组成，暗示了功能分化。启动子区富含ABRE和MeJA-motif等激素响应元件，表明这些基因与ABA和茉莉酸信号通路紧密关联。RT-qPCR分析揭示根部是碱性胁迫响应的主要部位，GmOXS3-1和GmOXS3-14是根中诱导最强的成员。功能分析表明，GmOXS3-1通过调节抗氧化防御能力和细胞水分平衡来负调控碱性耐受性。鉴于拟南芥OXS3同源物是ABA信号的负调控因子，GmOXS3-1可能通过ABA相关组分影响ROS清除，但这需要进一步验证。由于NaHCO₃处理同时施加了渗透/Na⁺毒害和高pH胁迫，未来的研究需采用pH缓冲液或对比NaCl与NaOH/NaHCO₃处理来区分特定的离子和碱性成分。

结论部分：本研究通过全基因组分析鉴定出19个大豆GmOXS3家族基因，系统发育分析将其分为三个亚家族。对外显子-内含子结构、保守结构域和基序、基因复制事件及蛋白序列一致性的分析表明，GmOXS3家族在进化过程中高度保守。表达分析显示多个GmOXS3成员在碱性胁迫下显著上调，其中GmOXS3-1和GmOXS3-14表现出最高的倍数变化。GmOXS3-1负调控碱性胁迫耐受性。综合来看，这些发现为阐明GmOXS3家族成员（特别是GmOXS3-1）在碱性胁迫响应中的作用及调控机制奠定了基础。尽管在实际应用于育种计划前，还需要在不同遗传背景和田间条件下进行进一步验证，并鉴定其下游靶标，但这些结果表明GmOXS3-1可作为大豆碱性耐受性遗传改良的潜在靶点。