《Vaccines》：Characterization of Seasonal Trivalent Influenza Vaccine Formulated with Different Ratios (v/v) of Squalene-Containing IB160 Adjuvant in One- or Two-Vial Presentations
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背景/目的：佐剂流感疫苗对于增强高风险人群（如老年人）的免疫应答至关重要。虽然早期研究依赖于免疫接种前将抗原与佐剂混合的两瓶装系统，本研究评估了将三价流感疫苗（TIV）与本地生产的基于角鲨烯的水包油乳剂IB160结合的一瓶装制剂的可行性、免疫原性和12个月稳定
背景/目的：佐剂流感疫苗对于增强高风险人群（如老年人）的免疫应答至关重要。虽然早期研究依赖于免疫接种前将抗原与佐剂混合的两瓶装系统，本研究评估了将三价流感疫苗（TIV）与本地生产的基于角鲨烯的水包油乳剂IB160结合的一瓶装制剂的可行性、免疫原性和12个月稳定性。方法：通过在动物模型中检测TIV:IB160（v/v）比例（1:1、2:1、3:1）来评估制剂，以血凝抑制（HI）抗体作为主要免疫原性指标，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行定性株特异性总IgG筛查作为补充。研究人员还比较了一瓶装和两瓶装策略的免疫应答。在6.0 °C ± 2.0 °C条件下，通过监测理化特征及其抗原应答、测定配制疫苗的血凝素含量以及长期HI抗体应答，评估了一瓶装和两瓶装系统的制剂稳定性。结果：与无佐剂TIV或3:1比例的佐剂TIV相比，2:1和1:1（v/v）制剂比例（15 μg TIV:IB160）在所有测试毒株（A/H3N2/Thailand、A/H1N1/Victoria和B/Austria）中诱导了显著更高的HI滴度。一瓶装和两瓶装策略均显示出显著高于无佐剂对照组的HI抗体应答（p < 0.05），两种递送形式之间未观察到显著差异。实际上，1:1和2:1比例的一瓶装制剂在12个月内保持稳定，保留了TIV抗原性、IB160乳剂完整性和强大的免疫原性。结论：一瓶装和两瓶装制剂在2:1和1:1（v/v）制剂比例（15 μg TIV:IB160）下均是可行、稳定且高度免疫原性的佐剂TIV替代方案。一瓶装形式简化了免疫接种物流，减少了操作错误，更适合常规使用，而两瓶装系统仍然是应急响应的多功能资产。
**研究背景与意义**
流感是一种重要的传染性呼吸道疾病，全球发病率高，据世界卫生组织（WHO）统计每年约导致29万至65万人死亡，主要病原为甲型和乙型流感病毒，可造成严重临床结局和季节性流行。WHO推荐全球免疫规划优先为60岁以上人群接种以降低重症病例，但该人群对流感疫苗的免疫应答减弱。为克服此限制，可将佐剂纳入疫苗制剂以刺激先天性和适应性免疫系统，增强总体效力并提供剂量节省效应。铝盐虽为数十年的传统佐剂选择，但基于角鲨烯的水包油乳剂（如MF59、AS03和AF03）已成为安全高效的替代方案，特别是已验证其能增强季节性和大流行性流感疫苗的免疫原性。布坦坦研究所（Instituto Butantan）认识到先进佐剂乳剂对公共卫生的重要性，在BARDA和WHO支持下与传染病研究所（IDRI）合作，实现本地生产基于角鲨烯的水包油乳剂佐剂IB160。该佐剂先在H7N9大流行禽流感疫苗中验证了价值：临床前研究显示显著增强免疫应答并降低所需抗原剂量，I期随机双盲临床试验确认了两剂后的剂量节省效应和强免疫原性；随后在H5Nx分支2.3.4.4b疫苗研究中同样显示良好结果，但仍需两剂才能达到合适的血凝抑制（HI）滴度。然而，从大流行场景转向常规季节性接种带来新挑战：大流行场景优先快速部署和灵活的抗原节省，两瓶装便于提前储备；而年度季节性接种活动需要优化生产和简化物流。基于此，本研究系统探索了季节性三价流感疫苗（TIV）联合IB160佐剂的制剂可能性。
**研究内容与主要结论**
研究人员评估了一瓶装（即用型）制剂将季节性TIV与IB160佐剂结合的可行性、免疫原性和12个月稳定性。研究探索了不同抗原佐剂体积比（1:1、2:1、3:1 v/v），比较了标准15 μg和更高30 μg抗原剂量，并比较了一瓶装与两瓶装策略的免疫应答。结果表明，2:1和1:1比例（每剂含0.25 mL IB160）在所有测试毒株中诱导显著更高的HI滴度，两种递送形式间无显著差异，且一瓶装制剂在12个月内保持稳定，保留TIV抗原性、IB160乳剂完整性和强免疫原性。该研究证明了一瓶装即用型制剂是可行、稳定且高度免疫原性的佐剂TIV替代方案，简化了免疫接种物流并减少操作错误，适合常规季节性接种使用；两瓶装系统则保留为应急响应的灵活资产。论文发表在《Vaccines》。
**关键技术方法**
研究人员使用雄性Wistar大鼠（3月龄，300–350 g，购自巴西ANILAB兽医实验室）作为动物模型，每组6只，单次肌内免疫，21天后采血。主要免疫原性指标为功能性血凝抑制（HI）抗体滴度，辅以ELISA定性筛查株特异性总IgG。理化分析采用动态光散射（DLS）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测IB160粒径、多分散性和颗粒浓度，高效液相色谱（HPLC）测定角鲨烯含量，单向免疫扩散（SRID）测定各流感毒株血凝素含量。制剂在6.0 °C ± 2.0 °C储存12个月，于初始、3、9和12个月时间点取样分析。
**研究结果**
*3.1 两瓶装制剂中TIV:IB160比例的评估*
研究人员通过HI试验检测不同比例制剂的功能性抗体应答。结果显示，仅1:1和2:1比例（15 μg TIV+IB160）的制剂在所有测试流感毒株（A/H3N2/Thailand、A/H1N1/Victoria和B/Austria）中均较无佐剂TIV产生显著更高的HI滴度，证实了IB160乳剂在此比例下的强佐剂效应。3:1比例的显著性呈毒株依赖性，仅对H1N1和B株显著，对A/Thailand株不显著。将抗原剂量增至30 μg而无佐剂时，较15 μg无佐剂剂量无显著获益；30 μg TIV联合IB160也未较30 μg TIV单独免疫显著提高HI滴度。因此，研究人员选择1:1和2:1比例（15 μg TIV+IB160）进行后续分析。
*3.2 一瓶装或两瓶装制剂是佐剂TIV疫苗的可行替代方案且优于无佐剂TIV疫苗*
通过定性总IgG筛查和HI试验比较两种递送形式，结果显示一瓶装和两瓶装制剂在所有测试毒株间均无显著差异，证实两种制剂策略在功能上等效。显著差异严格限于所有IB160佐剂制剂与PBS和IB160对照组或无佐剂15 μg TIV之间的比较。这表明无论将抗原和佐剂填充在同一小瓶还是分装于两个小瓶，两种佐剂TIV制剂策略均可行且免疫原性相当。
*3.3 制剂策略（一瓶装和两瓶装）在12个月内保持稳定*
制剂在6 ± 2 °C储存12个月以覆盖季节性TIV接种活动期间的使用。免疫原性稳定性评估显示，所有时间点免疫动物均无体重下降，无不良事件发生；一瓶装和两瓶装制剂在各时间点的株特异性总IgG和HI抗体滴度均保持稳定。理化参数方面，IB160粒径维持在130–190 nm规格限内，多分散性指数（PdI）< 0.2表明无聚集，颗粒浓度和角鲨烯含量在12个月内保持稳定，与两瓶装中IB160小瓶的结果相似。一瓶装制剂的pH更接近抗原而非单独IB160乳剂的pH，但不改变佐剂的理化或免疫原性性质。SRID分析确认各流感单份毒株的血凝素含量在12个月内无变化，每剂达到15 μg最低抗原量要求。
**讨论与结论**
讨论部分指出，15 μg与30 μg无佐剂制剂在HI滴度上无统计学差异，这与既往临床试验一致：将标准抗原含量从15 μg加倍至30 μg不能改善血清抗体应答，而批准的高剂量制剂（60 μg/剂，Fluzone）可显著增强老年人免疫原性。佐剂介导的免疫增强依赖于免疫接种中所用角鲨烯乳剂佐剂的最小体积：1:1和2:1比例均保持每剂0.25 mL佐剂体积，显示统计优势；而3:1比例每剂仅含0.125 mL佐剂，不足以产生显著增强，这与Hatz等人和Della Cioppa等人报道的佐剂剂量-应答动力学一致。一瓶装形式从终端用户角度最为理想，可大幅降低混合错误风险并简化接种操作；生产方面可减少多条灌装线和存储空间从而降低运营成本。类似地，Fluad疫苗即为流感抗原与MF59佐剂预填充于注射器的先例。两瓶装形式的价值未被削弱：它允许预先储备已灌装的IB160，在不需长期稳定性研究先决条件的情况下实现快速部署和抗原节省灵活性，适合疫情应急；而一瓶装形式适合可预测、高吞吐量的年度常规季节性活动。研究局限性包括：每组6只大鼠的样本量虽然统计学上足以检测差异，但更大样本可进一步验证；较大注射体积（0.75 mL，用于2:1比例）需通过双侧后肢分开注射，双侧肌内操作虽耐受良好，但较大体积可能因局部组织损伤程度不同而影响免疫应答。
研究结论为：本研究报告的结果表明，IB160佐剂介导的佐剂TIV免疫应答增强取决于制剂中所用佐剂的量；结果进一步证实，以有效剂量包含佐剂即可产生佐剂TIV的优越免疫应答，无论其是在独立小瓶中还是即用型单瓶制剂中配制。两种制剂策略间观察到的可比较免疫原性（通过HI试验确定）和稳定性特征，凸显了在流感疫苗制剂中使用佐剂的临床可行性和灵活性。因此，IB160佐剂可通过不同策略使用：高度敏捷的两瓶装疫苗形式用于快速大流行应对和部署，以及优化的季节性接种活动所用的即用型单瓶装形式。
