《Applied and Environmental Microbiology》：Population-level genomic surveillance of human norovirus using wastewater-based whole-genome sequencing
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基于废水的监测作为一种有价值的方法日益受到关注，它能够捕获通常难以通过临床报告系统单独检测的社区水平感染动态。在本研究中，研究人员分析了在韩国光州采集的废水样本中的人诺如病毒基因型分布和全基因组水平变异。这些结果与一则有记录的食物中毒暴发事件结合解读，以评估基
基于废水的监测作为一种有价值的方法日益受到关注，它能够捕获通常难以通过临床报告系统单独检测的社区水平感染动态。在本研究中，研究人员分析了在韩国光州采集的废水样本中的人诺如病毒基因型分布和全基因组水平变异。这些结果与一则有记录的食物中毒暴发事件结合解读，以评估基于废水的监测的流行病学相关性。使用基于TaqMan阵列卡的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对人诺如病毒浓度进行定量，并进行全基因组下一代测序（NGS），以获得病毒读段数及每千碱基每百万过滤读段读数（RPKMF）值。总体而言，RT-qPCR浓度与NGS衍生指标之间观察到强相关性。基因型动态在不同废水处理厂之间存在差异，反映了汇水区面积和当地人群特征的差异。特别是，GII.17[P17]的相对丰度在第50流行病学周增加，时间上与记录在案的当地食物中毒暴发相吻合。变异分析显示，废水样本呈现混合核苷酸模式，多种等位基因以不同相对频率共存，而非固定替代。值得注意的是，在临床样本中检测到的某些非同义变异也在暴发期前后的废水样本中被观察到。总之，这些发现表明，基于废水的全基因组监测能够在人群尺度上捕获基因型水平的变化和核苷酸水平的动态，凸显其作为监测社区水平诺如病毒循环和暴发相关基因型动态补充工具的潜力。
人诺如病毒是全球急性胃肠炎和食源性暴发的主要病原体。在韩国，它是最常检出的肠道病毒，持续构成公共卫生负担。传统临床监测依赖有症状就医患者的粪便样本进行RT-PCR检测，但约21.8%的感染为无症状，且无症状与有症状患者排出相似病毒载量和相似时长，因此临床监测会低估社区真实传播水平。废水监测能够非选择性捕获社区中所有个体（无论症状和就医行为）的病毒排泻信号，尤其适合诺如病毒。然而废水样本含复杂微生物群落和环境抑制物，需要全基因组下一代测序（NGS）进行高分辨率解析。本研究旨在结合废水监测和全基因组测序，描述2024年第36至52周韩国光州三个废水处理厂（WWTP）中人诺如病毒基因型的时间变化和核苷酸变异，并与一起食源性暴发进行比较，评估该整合方法在社区水平监测中的效用。论文发表在《Applied and Environmental Microbiology》。
研究人员在光州三座WWTP（Site 1覆盖约83%人口，Site 2约16%，Site 3约1%）每周采集1升进厂废水，使用TaqMan阵列卡RT-qPCR定量人诺如病毒浓度，并对GII型进行全基因组NGS；同时收集疑似食物中毒暴发中22名症状者的直肠拭子样本。主要结论是：NGS衍生指标与RT-qPCR浓度总体强相关，NGS指标可反映病毒载量相对变化；GII.17[P17]基因型在第50周后相对丰度增加，与暴发时间吻合；废水中存在混合核苷酸变异，部分临床相关变异在暴发前已被检出；废水全基因组监测能在人群水平捕捉基因型和核苷酸动态，可作为传统临床监测的补充策略。
技术方法方面，研究人员每周从三个污水处理厂采集1升进厂废水，以枯草芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）作为提取对照，离心后使用自动提取系统提取病毒RNA，并通过TaqMan Array Card平台进行逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）定量。测序采用两种策略：所有废水样本使用杂交捕获富集（Illumina Viral Surveillance Panel）后在NovaSeq 6000平台测序；部分周次（流行病学周38、39、48至50）的废水样本及暴发相关临床样本使用基于扩增子的Genexus系统测序。生物信息学使用EsViritu流程去除宿主序列并比对病毒参考数据库，通过人类杯状病毒分型工具确定基因型，用CLC Genomics Workbench进行变异调用，以GII.17[P17]参考基因组PQ310520为参照，Nextalign比对后用SNIPIT可视化。样本队列来源包括光州三座WWTP的进水样本和同一时期暴发相关的22份直肠拭子样本。
**人诺如病毒定量载量与NGS指标之间的关联**：通过相关性分析发现，Site 1和Site 2中RT-qPCR浓度与NGS读段数及每千碱基每百万过滤读段读数（RPKMF）强正相关（读段数R分别为0.919和0.812；RPKMF R分别为0.987和0.777），而Site 3相关性较弱（R=0.386和0.266），表明大汇水区样本更能代表社区整体信号，NGS指标可反映病毒载量的相对时间变化。
**主要人诺如病毒GII基因型的时间变化**：基于RPKMF值估算各基因型相对丰度，发现GII.4[P16]和GII.17[P17]为优势基因型。第50周后，三个站点中GII.17[P17]的相对丰度和原始RPKMF值均增加；Site 1和Site 2中GII.4[P16]也显著增加。GII.17[P17]在整个研究期间于三个站点均持续检出，提示该基因型在暴发前已在社区内循环。
**疑似食源性暴发中人诺如病毒检测与分型**：对22份直肠拭子进行检测，16份人诺如病毒GII阳性，其中12份为GII.17[P17]，4份未分型。这一结果将暴发明确归因于GII.17[P17]，与废水检测中该基因型的时间上升相吻合。
**临床和废水来源人诺如病毒GII.17[P17]核苷酸变异的时间模式**：以PQ310520为参考，临床样本中鉴定出35个单核苷酸多态性（SNP），其中3个为非同义替换：ORF1位置4401（I>T）、4457（A>T），ORF2（VP1）位置6156（F>I）。对废水样本的比较显示，这些位点并非固定为单一碱基，而是参考型与变异型等位基因以不同相对比例混合存在，且随周次动态变化。例如位置4457在后期（第49、50周）临床型核苷酸比例增加，位置6156在整个采样期均以临床型为主。部分临床相关变异在暴发前的废水中已可检出。
讨论指出，废水样本因PCR抑制剂、RNA降解、进水流量波动等存在固有变异性，导致各站点相关性强度不一，但整体强相关，支持NGS作为废水监测的补充手段。Site 3较弱可能与其服务人口少（约5万人）、更易受局部排泻波动影响有关，但该解释需谨慎看待。第50周后GII.17[P17]的增加与韩国全国基因型替换趋势以及欧洲、美国、中国同期发现的GII.17[P17]复兴现象一致。由于缺少详细汇水区边界，不能将暴发直接归因于特定站点，但暴发前持续检出支持该基因型已在社区循环。废水中以混合变异为主，提示暴发相关变异可能预先存在于病毒准种库中。局限性包括缺少光州当地历史参考基因组，以及未监测实际温度和PCR抑制剂影响。结论部分翻译如下：本研究表明，基于废水的全基因组监测可作为人群水平的监测工具，用于表征社区范围内的人诺如病毒循环。全基因组NGS成功应用于废水样本，能够描述基因型分布和人群水平基因组变异。废水来源的基因组信号与暴发相关临床基因组的一致性，进一步证明了废水全基因组测序在监测社区水平诺如病毒循环方面的实用性。此外，某些变异在废水中与临床检出同时甚至更早出现，提示基于废水的基因组监测可能通过提供与新兴暴发相关的早期基因组信号来补充临床监测。总体而言，将废水监测与全基因组NGS相结合，为监测循环中的诺如病毒群体提供了一个高分辨率框架，并支持其作为未来传染病监测系统补充组件的更广泛应用。
