《Applied and Environmental Microbiology》：Bacterial microbiomes and antifungal effect of Danish wood ant (Formica polyctena) populations
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蚂蚁（包括木蚁，*Formica polyctena*）能够控制节肢动物害虫，而近期研究也强调其对抗植物病原菌的潜力，这种效应可能得益于具有抗菌活性的蚂蚁共生微生物。本研究调查了丹麦五个地点的木蚁（*F. polyctena*）及其巢穴的细菌微生物组。研究人员
蚂蚁（包括木蚁，*Formica polyctena*）能够控制节肢动物害虫，而近期研究也强调其对抗植物病原菌的潜力，这种效应可能得益于具有抗菌活性的蚂蚁共生微生物。本研究调查了丹麦五个地点的木蚁（*F. polyctena*）及其巢穴的细菌微生物组。研究人员评估了蚂蚁沉积具有抑制经济上重要的植物病原真菌——苹果褐腐病菌（*Monilinia fructigena*）、灰葡萄孢菌（*Botrytis cinerea*）和禾谷镰刀菌（*Fusarium graminearum*）作用的抗菌微生物的能力，并假设所沉积的微生物是蚂蚁表面特定微生物组的一部分。为验证此假设，研究人员分别对蚂蚁的腿部与躯体进行采样，并假定腿部的细菌群落与躯体和巢穴的微生物组存在差异。结果显示，蚂蚁在琼脂平板上爬行10秒内即沉积了抗菌微生物，而24小时的暴露则导致琼脂平板上出现密集的微生物生长。研究人员分离出7株细菌和7株真菌抗菌菌株，其中6株细菌分离物的16S rRNA序列与来自所有地点蚂蚁微生物组的扩增子序列变异体（ASV）匹配。这些序列在蚂蚁躯体与腿部的相对丰度和检出率均高于巢穴样本，表明这些分离菌株来源于蚂蚁表面微生物组。五个地点的蚂蚁细菌微生物组组成相似，且以内共生菌沃尔巴克氏体（*Wolbachia*）为主导；同时，躯体、腿部和巢穴之间的微生物组存在显著差异，表明蚂蚁表面微生物组是选择性获得而非从环境中随机获取。这些发现表明，木蚁具有独特的腿部微生物组，并持续携带有潜力对抗植物病原真菌的抗真菌微生物。
**重要性**：本研究首次对木蚁（*Formica polyctena*）及其巢穴的细菌微生物组进行了全面研究，为了解蚂蚁与抗菌微生物的关联及其微生物组的组成和分区提供了宝贵见解。研究结果强调，木蚁普遍携带对具有商业重要性的植物病原真菌有效的抗菌微生物，凸显了其作为农业生物防治制剂的潜力。此外，结果表明木蚁的细菌微生物组以沃尔巴克氏体（*Wolbachia*）内共生菌高度主导，而木蚁腿部、躯体和巢穴的细菌微生物组均存在显著差异，提示木蚁微生物组是选择性获得而非从环境中随机获取。总之，本研究为木蚁微生物组提供了新见解，并强调了利用蚂蚁及其共生微生物作为植物病原真菌生物防治制剂的潜力。
**一、研究背景与科学问题**
长期以来，蚂蚁被证明可有效控制多种作物上的害虫。近年研究进一步表明，包括木蚁（*Formica polyctena*）在内的多种蚂蚁可降低植物病原菌的发病率，如苹果褐腐病（*Monilinia fructigena*）和苹果黑星病（*Venturia inaequalis*）。然而，木蚁产生这一效应的机制尚未被深入探究，其与微生物的关联可能发挥重要作用。蚂蚁营社会性生活，密集的亲缘个体增加了疾病传播风险，为此蚂蚁进化出多种防御机制，包括分泌蚁酸等抗菌化学物质以及与抗菌微生物共生。已有研究发现，实验室木蚁种群在琼脂平板上爬行时会留下微生物踪迹，其中部分沉积微生物可抑制植物病原真菌。但经紫外线表面灭菌后，该抑制效应显著降低，提示蚂蚁表面相关微生物在病原抑制中具有关键作用。
然而，木蚁的微生物群落研究极为匮乏，若干关键问题尚待解答，包括：木蚁与抗菌微生物的关联有多普遍？这些微生物源自何处？是来自巢穴、蚂蚁表面的隐窝或腺体外共生菌、肠道与粪便排泄物，还是环境中随机获得？此外，现有蚂蚁微生物组研究普遍采用表面灭菌处理，这可能剔除表面相关微生物，掩盖其潜在的病原防御功能。
基于此，研究人员提出假设：（i）不同地理区域的木蚁持续沉积抗菌微生物；（ii）蚁巢、蚁体与蚁腿的微生物组彼此不同，从而提示沉积的抗菌微生物可能源自特定的蚂蚁表面微生物组，而非肠道或巢穴微生物组。
**二、研究方法概述**
研究人员于2022年9月至10月从丹麦五个地点（日德兰半岛东部EJ、北部NJ、南部SJ、西部WJ及西兰岛Z）采集木蚁及巢穴样本。每个地点选取一个超级蚁群的6个巢穴，每巢采集10只蚂蚁（分别单独取样）及1份混合巢穴样本，共90只活蚁用于抗菌活性测定。蚂蚁经干冰冷冻后，用无菌镊子分离腿部和躯体，分别置于含ATL缓冲液的管中。巢穴样本取自表层（约2–5 cm深）的上、中、下三层并混合。
实验设计包括：（1）单只蚂蚁在预接种苹果褐腐病菌（*M. fructigena*）的平板上自由爬行10秒，检测微生物足迹的抑制效应；（2）三只蚂蚁在平板上爬行24小时后，再分别接种三种病原真菌（*M. fructigena*、*B. cinerea*、*F. graminearum*），以最大化微生物沉积量。对具有明显抑制圈的沉积微生物进行分离纯化，通过菌落PCR和Sanger测序（16S rRNA基因和ITS区域）鉴定菌种，并测定各分离物对三种病原真菌的抑制活性。同时，提取蚂蚁腿、躯体及巢穴样本的总DNA，对细菌16S rRNA基因V3–V4区进行扩增子测序（Illumina MiSeq平台），经DADA2进行质量过滤、降噪和双端合并，获得扩增子序列变异体（ASVs），并利用Silva数据库进行分类学注释。α多样性、β多样性（主成分分析PCA）、多元Welch ANOVA（WdStar检验）、差异丰度分析（ANCOM-BC）和Venn图分析等方法用于比较不同样本类型和地点间的细菌群落组成差异。
**三、主要研究结果**
**抗菌足迹**：来自全部五个地点的蚂蚁均携带并沉积抗菌微生物，表明该关联并非局限于特定蚁群或地点，而是丹麦木蚁的普遍属性。40%的平板上，单蚁爬行10秒内即沉积了抗菌微生物，形成超过70个具抑制圈的菌落，成功分离8株。三蚁爬行24小时的平板上，沉积微生物量极高，多数情况下完全覆盖平板，从中分离出6株具清晰抑制圈的菌株。共获得14株抗菌分离物（7株细菌、7株真菌），其中5株能抑制全部三种测试病原真菌，另外7株能抑制其中两种并降低第三种（*B. cinerea*）的生长。细菌分离物属于4个不同属（*Rahnella*、*Bacillus*、*Rouxiella*、*Pseudomonas*），4株真菌属于青霉属（*Penicillium*），其余3株未能鉴定到种。其中6株细菌分离物的16S rRNA基因序列与蚂蚁体、腿和巢样本中检出的ASVs匹配，这些ASVs在五个地点均有分布，且在腿部和躯体样本中的相对丰度和检出率均高于巢穴样本，表明它们来自蚂蚁表面微生物组。
**细菌群落组成**：16S rRNA基因扩增子测序显示，巢穴样本的α多样性远高于蚂蚁样本（巢穴观测ASVs超过1000个，蚂蚁仅90–150个），且蚂蚁躯体与腿部之间的α多样性也存在显著差异。内共生菌沃尔巴克氏体（*Wolbachia*）在巢穴中几乎不存在（平均相对丰度MRA<0.1%），但主导了蚂蚁躯体（MRA±SE：69±0.2%）和腿部（94±0.1%）的细菌群落。去除*Wolbachia*后的PCA分析显示，蚂蚁（躯体和腿部）的细菌群落组成与巢穴存在显著差异，且蚂蚁躯体与腿部的群落也存在显著差异；五个地理位点之间的细菌群落亦有显著差异。
**躯体与腿部微生物组的差异**：去除*Wolbachia*后，蚂蚁躯体样本的细菌群落以已知的蚂蚁肠道相关菌群为主导，仅三个属即占所有读数的60%以上，包括醋杆菌科（*Acetobacteraceae*）未分类属（22±1%）、乳酸杆菌属（*Lactobacillus*）（28±1%）和*Neokomagataea*（17±1%）。腿部样本包含部分躯体（如*Serratia*及上述属）与巢穴（如*Pseudomonas*、*Sphingomonas*、*Mycobacterium*、*Mucilaginibacter*）中共有的属，但未表现出特定属的普遍优势。腿部样本中检出率≥50%的特有ASVs属于黄杆菌纲（*Flavobacteria*）、Candidatus Yonathbacteria和棒杆菌目（*Corynebacteriales*），相对丰度较低。值得注意的是，分离出多种抗菌菌株的拉恩氏菌属（*Rahnella*）和沙雷氏菌属（*Serratia*，包括*Rouxiella*）位列蚂蚁腿部前20个属，但未进入巢穴样本的前20个属，表明这些抗菌微生物源自蚂蚁表面而非巢穴。
**样本间共享与特有ASVs**：在检出率≥50%的ASVs中，仅9个ASVs在三个样本类型间有共享。乳酸杆菌属（*Lactobacillus*）是唯一在躯体、腿部和巢穴中均存在的ASV，其在躯体样本中相对丰度最高，其次为腿部和巢穴。蚂蚁腿部与躯体共享4个ASVs，其中属于棒杆菌目未分类属的ASV_11是除已知内共生菌（*Wolbachia*）和肠道菌（*Lactobacillus*）之外唯一共享的高检出率ASV，其在躯体中的相对丰度（4.8±0.47%）高于腿部（1.1±0.25%）。躯体与巢穴之间无共享ASVs，腿部和巢穴之间则有4个ASVs（分属3个属）共享。巢穴样本的特有ASVs数量最多，其细菌群落组成最多样且与蚂蚁群落明显不同。蚁群水平分析表明，跨蚁群共享的高丰度ASVs也是各蚁群内部的主导ASVs，且不存在仅在巢穴与躯体间共享的ASVs，从而拒绝了蚁群特异性微生物仅在同巢内传播的观点，但提示部分蚁群的蚂蚁会从巢穴环境中获得微生物。
**四、讨论总结与研究结论**
**讨论部分总结**：本研究首次对丹麦五个地点的木蚁及其巢穴细菌微生物组进行了全面分析，证实木蚁普遍携带并沉积可抑制至少一种测试植物病原真菌的抗菌细菌和真菌。此发现与从其他蚂蚁物种中分离抗菌微生物的研究一致，但既有研究多集中于高度特化的共进化系统（如切叶蚁与蚁食植物蚂蚁），而本研究表明木蚁作为非特化蚁种，其抗菌微生物关联具有普遍性。蚂蚁躯体、腿部和巢穴的细菌微生物组显著不同：巢穴微生物组多样性最高且与蚂蚁差异最大，躯体与腿部相对更相似但仍显著不同。腿部的*Wolbachia*相对丰度高于躯体，符合其内共生菌的特性；躯体则以已知的蚂蚁肠道共生菌（*Lactobacillus*、*Neokomagataea*、*Acetobacteraceae*）为主导。腿部微生物组区别于躯体和巢穴，表明其并非简单地从肠道、巢穴或环境随机组装，而是具有自身选择性组合。ASV_11（棒杆菌目）与已知的澳大利亚织叶蚁和日本弓背蚁来源序列高度相似，提示其可能代表蚂蚁相关外共生菌的一个新属。研究中6株细菌分离物的ASVs在五个地点均有分布，且在腿部检出率和丰度高于巢穴，进一步证实其源自蚂蚁表面微生物组。部分分离菌株与已知生物防治菌种高度同源，如解淀粉芽孢杆菌（*Bacillus amyloliquefaciens*）、*Rouxiella chamberiensis*和*Pseudomonas*属，均具有抑制植物病原真菌的潜力。
**研究结论翻译**：本研究首次对木蚁及其巢穴的细菌微生物组进行了全面研究，证明不同地理位置的木蚁在琼脂平板上爬行时会沉积抗菌微生物。研究结果表明，木蚁与多种可拮抗植物病原真菌的抗菌微生物之间存在普遍关联。木蚁躯体、腿部和巢穴样本的细菌微生物组存在显著差异，表明蚂蚁携带独特的微生物组，并非从巢穴环境中随机获得。此外，抗菌细菌分离物在蚂蚁腿部的高丰度和高检出率提示，这些微生物主要源自蚂蚁表面相关微生物组，而非蚂蚁肠道或巢穴。研究结果强调了利用蚂蚁及其表面微生物组作为植物病原真菌生物防治制剂的潜力。
