《Animals》：Genome-Wide Identification of the TRAF Gene Family in Common Carp (Cyprinus carpio) and Analysis of Their Expression in Response to CyHV-3 Challenge
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肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）是先天免疫中的关键信号转导分子，参与多种免疫通路，如TNF受体和Toll样受体信号通路。本研究从鲤鱼基因组中鉴定出16个CcTRAFs，归属于六个亚家族（TRAF1/2/3/4/6/7），未发现TRAF5。在TRAF2/4
肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）是先天免疫中的关键信号转导分子，参与多种免疫通路，如TNF受体和Toll样受体信号通路。本研究从鲤鱼基因组中鉴定出16个CcTRAFs，归属于六个亚家族（TRAF1/2/3/4/6/7），未发现TRAF5。在TRAF2/4亚家族中观察到显著的旁系同源扩增。ProtParam分析预测所有CcTRAF蛋白均为不稳定且亲水性蛋白；大多数蛋白含有保守的RING、TRAF和MATH结构域，而CcTRAF7携带七个WD40结构域。基因结构和保守基序分析显示，各亚家族内部的外显子数目和基序组成高度保守，而TRAF7亚家族则表现出独特的结构特征。共线性分析进一步表明，片段重复促进了CcTRAF家族的扩增。qRT-PCR结果显示，CcTRAF基因具有组织特异性表达模式，并在肝脏、脾脏和肾脏中优先表达。在CyHV-3感染条件下，这些组织中CcTRAF3/6/7的表达水平先升高后降低，在攻毒后48 h达到峰值。综上所述，CcTRAF基因，尤其是CcTRAF3/6/7，在鲤鱼抵抗CyHV-3的免疫应答中发挥重要作用。本研究为理解硬骨鱼类先天免疫调控及TRAF基因功能提供了分子基础。
论文解读：鲤鱼TRAF基因家族的全基因组鉴定及其对CyHV-3感染的表达响应分析
一、研究背景与意义
肿瘤坏死因子受体相关因子（Tumor necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs）是一类重要的免疫信号转导分子，自20世纪90年代被发现以来，已被证实是先天性和适应性免疫信号通路的核心调控因子。TRAF家族成员广泛参与Toll样受体、NOD样受体、RIG-I样受体、C型凝集素受体、T细胞受体、肿瘤坏死因子受体超家族以及多种白细胞介素受体和干扰素受体的信号传递，在抗感染、炎症反应、细胞凋亡、增殖分化及肿瘤发生等众多生理和病理过程中发挥关键作用。在哺乳动物中已鉴定出7个TRAF家族成员，包括6个经典成员（TRAF1–TRAF6）和1个非经典成员TRAF7。除TRAF7外，大多数TRAF蛋白在C端含有TRAF结构域，该结构域由约230个氨基酸残基组成，包含卷曲螺旋构象的TRAF-N区域和富含β折叠的TRAF-C（又称MATH）结构域。TRAF7的C端不含MATH结构域，取而代之的是7个WD40重复序列。除TRAF1外，其他TRAF蛋白的N端均含有保守的RING指和锌指结构域，其中RING指结构域赋予其E3泛素连接酶活性，调控下游NF-κB信号通路的激活。
与哺乳动物类似，硬骨鱼类也拥有TRAF家族成员，且TRAF家族成员在抗病毒免疫应答中表现出功能分化。例如，赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）TRAF2通过激活NF-κB和JNK通路发挥抗病毒功能；大黄鱼（Larimichthys crocea）TRAF3参与TLR信号通路调控抗病毒免疫，而TRAF4则通过促进病毒复制对抗病毒免疫应答产生负面影响；石斑鱼TRAF5在增强SGIV复制的同时显著激活IFN-β和NF-κB启动子活性，提示病毒可能劫持TRAF5介导的信号通路以逃避免疫监视；青鱼MAVS通过招募TRAF6传递抗病毒信号以调控宿主抗病毒免疫应答。目前对鲤鱼TRAF家族的认知仅限于少数成员，如鲤鱼TRAF3已被证明参与RIG-I抗病毒信号通路，TRAF6存在两个旁系同源拷贝并参与TLR介导的抗病毒免疫调控。然而，鲤鱼中其他TRAF家族成员的系统鉴定和功能表征仍然缺乏，系统的进化分析、基因结构特征及CyHV-3攻毒过程中的动态表达谱尚未见报道。
鲤鱼是世界上品种最多、分布最广、养殖历史最悠久的淡水鱼类，也是中国重要的经济水产养殖物种。由CyHV-3引起的锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）已在全球范围内传播，给鲤鱼养殖业造成重大经济损失。因此，深入了解鲤鱼的免疫应答机制对于控制该疾病至关重要。
二、主要技术方法
研究人员从NCBI RefSeq数据库获取鲤鱼染色体水平参考基因组组装GCF_018340385.1，利用来自12个物种的TRAF蛋白序列进行Blastp搜索，并结合Pfam数据库中zf-TRAF（PF02176）和MATH（PF00917）结构域的隐马尔可夫模型（HMM）进行全基因组鉴定。通过SMART和Pfam工具验证保守结构域，使用ExPASy ProtParam分析理化性质。系统发育树采用MEGA11邻接法（NJ）构建，1000次自举检验。基因结构分析使用GSDS 2.0，染色体定位和共线性分析使用TBtools。实验材料为来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所宽甸实验站的健康鲤鱼（平均体重8–12 g），经PCR验证CyHV-3阴性后，采用CyHV-3组织匀浆浸泡攻毒模型，在攻毒后0、24、48、72、96和120 h采集肝脏、头肾、脾脏等组织，利用qRT-PCR检测基因表达。
三、研究结果
3.1 CcTRAF家族的鉴定及理化性质
在鲤鱼基因组中共鉴定出16个TRAF基因，命名为CcTRAF1、CcTRAF2aa、CcTRAF2aa1、CcTRAF2ab、CcTRAF2ab1、CcTRAF2b、CcTRAF2ba、CcTRAF3a、CcTRAF3b、CcTRAF4a、CcTRAF4aa、CcTRAF4b、CcTRAF6a、CcTRAF6b、CcTRAF7和CcTRAF7a。编码蛋白长度为470–725个氨基酸，分子量范围为54,395.36–81,142.81 Da，等电点范围为6.29–8.55。所有成员的不稳定指数均大于40.00，预测为不稳定蛋白；脂肪族指数范围为63.26–84.39；平均疏水指数小于零，均为亲水性蛋白。
3.2 CcTRAF蛋白的结构特征
二级结构预测显示所有CcTRAF家族成员均含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规卷曲结构。TRAF1/2亚家族的α-螺旋含量最高，其次为无规卷曲；TRAF3/4/6亚家族则呈现较高的无规卷曲比例，α-螺旋为第二丰富的二级结构；TRAF7亚家族α-螺旋比例较低而延伸链比例较高，表现出与其他TRAF成员完全不同的结构特征。三级结构预测显示同一亚家族成员间高度相似，不同亚家族间存在明显差异。同源建模的GMQE值范围为0.73–0.92，模板序列一致性为74.20%–98.94%。
3.3 CcTRAF的系统发育分析
利用13个物种共107个TRAF基因构建系统发育树，分为七个亚家族。亚家族I含5个TRAF1基因，亚家族II含35个TRAF2基因，亚家族III含14个TRAF3基因，亚家族IV含16个TRAF4基因，亚家族V含9个TRAF5基因，亚家族VI含14个TRAF6基因，亚家族VII含14个TRAF7基因。各亚家族内物种聚类遵循脊椎动物进化规律，鲤科鱼类TRAF成员首先聚在一起。值得注意的是，TRAF2和TRAF4亚家族表现出旁系同源扩增，而鲤鱼缺乏TRAF5基因，体现了物种特异的进化特征。
3.4 CcTRAF基因的结构特征
基因结构分析显示，亚家族VII含有的外显子数目最多，为20个；亚家族IV外显子数目最少，仅7个。每个亚家族内部的外显子数目相对一致，进一步表明亚家族内的高度保守性。
3.5 CcTRAF的保守结构域、基序模式及染色体分布
除CcTRAF7外，所有CcTRAF蛋白均含有保守的RING、TRAF和MATH结构域。CcTRAF7含有7个WD40重复序列。亚家族I和II具有高度相似的结构域组成，均含有BIRC3结构域；亚家族IV含有3个典型TRAF结构域；亚家族VI含有2个典型TRAF结构域和1个卷曲螺旋结构域。保守基序分析共鉴定出10个基序，除CcTRAF7外，其他CcTRAF蛋白的基序组成大体相似。染色体定位分析显示CcTRAF基因均匀分布于A3、A5、A7、A15、A17、A21、B3、B5、B7、B8、B15和B17染色体上。
3.6 CcTRAF基因的共线性分析
种内共线性分析显示多个CcTRAF基因之间存在稳健的共线性关系，证明片段重复是驱动CcTRAF家族扩增的主要力量。CcTRAF2亚家族的多个旁系同源基因共享共线基因组区域，验证了鲤鱼进化过程中该亚家族谱系特异的复制事件。种间共线性比较发现鲤鱼TRAF基因与斑马鱼直系同源基因之间存在高度保守的染色体片段，与鲤科鱼类特异的全基因组复制事件（Ts3R）一致；而鱼类与人类TRAF位点之间的共线性保守性较弱。
3.7 CcTRAF的组织表达谱
所有CcTRAF家族成员均表现出显著的组织特异性表达模式。CcTRAF1/2b/2ba/3a/6b/7a在脾脏中显著富集；CcTRAF2ba/4b/6a主要在肝脏中表达；CcTRAF2ab/2ab1在肾脏中高表达；CcTRAF3b/6a/6b在头肾中维持较高转录水平；CcTRAF4a/4aa在心脏中高表达；CcTRAF2aa/2aa1/7主要在脑中特异性上调。总体而言，大多数CcTRAF基因在肝脏、脾脏和头肾等核心免疫器官中高表达。
3.8 CyHV-3攻毒下CcTRAF的时间表达模式
在肝脏中，CcTRAF2b/2ba/3a/3b/6a/6b/7/7a在攻毒后48 h显著上调并达到峰值，随后下降；CcTRAF4a在72 h达到最高表达水平。在脾脏中，CcTRAF2b/2ba在48 h表达最高；CcTRAF3a/3b/6a/6b/7/7a显著上调并在72 h达到峰值。在头肾中，CcTRAF1/2aa/2aa1/2ab/2ab1/4aa/7呈现先下调、后上调、后期持续下降的动态表达模式；而CcTRAF2b/2ba/3a/3b/6a/6b/7a的时间表达模式与肝脏和脾脏中的表现一致。
四、讨论与结论
讨论部分指出，TRAF家族在鲤鱼中经历了比已报道的其他硬骨鱼类更为广泛的复制扩增。鲤鱼含有6个TRAF2旁系同源基因，且TRAF3、TRAF4、TRAF6和TRAF7各拥有2–3个复制拷贝。这种全基因组范围的广泛复制与鲤科鱼类特有的第四次全基因组复制事件（WGD）及异源多倍化密切相关，使鲤鱼拥有比哺乳动物和其他硬骨鱼类更复杂和多样化的免疫系统。保守结构域分析显示CcTRAF1/2特有的BIRC3结构域参与抗凋亡调控，提示这两个旁系同源基因的功能特异性。组织表达分析表明大多数CcTRAF基因在免疫相关组织中优先高表达，与TRAF家族在鱼类免疫中的保守功能一致。在CyHV-3攻毒条件下，CcTRAF1和CcTRAF4的整体表达受到抑制，提示其可能作为负调控因子缓解过度炎症反应；不同CcTRAF2旁系同源基因表现出不同的响应模式，暗示其在NF-κB和JNK信号中可能发挥分化功能；CcTRAF3在攻毒后48 h和72 h在肝脏、脾脏和头肾中持续高表达，揭示其长期参与宿主抗病毒免疫防御；CcTRAF6在攻毒后48 h在肝脏和脾脏中显著升高，显示其在早期转录响应中的显著诱导；CcTRAF7在所有免疫组织中均表现出不同程度的上调，其表达峰值随时间逐渐下降，与先前研究报道的表达模式高度一致，提示CcTRAF7是CyHV-3攻毒下转录免疫应答的候选基因。
研究结论为：本研究系统开展了鲤鱼CcTRAF基因家族的全基因组鉴定、进化分析、组织表达谱及CyHV-3攻毒下的表达谱分析。组织表达谱显示所有CcTRAF基因在所有检测组织中普遍分布，并在脾脏、头肾和肝脏等免疫器官中优先高表达。在病毒攻毒条件下，不同CcTRAF基因表现出多样的表达响应。CcTRAF3/6/7是鲤鱼在CyHV-3攻毒下转录抗病毒应答的候选基因。上述发现阐明了TRAF家族在鲤鱼抵抗CyHV-3先天免疫中的差异响应特征，补充了硬骨鱼类TRAF基因功能的研究数据，为进一步阐明抗病毒分子机制和培育抗病鲤鱼奠定了基础。
