肠致病性大肠杆菌（EPEC）EspZ 中的跨膜区促进寡聚化并有助于感染肠上皮细胞存活

《Microbiology Spectrum》：A transmembrane region in EPEC EspZ promotes oligomerization and contributes to survival of infected intestinal epithelial cells

　　

肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）是幼龄腹泻发病与死亡的重要病原。EPEC 的 III 型分泌系统（Type III Secretion System，T3SS）向宿主肠上皮细胞注入约 21 种效应蛋白。EspZ 是感染早期分泌的效应蛋白，可延迟宿主细胞死亡、调控效应蛋白转位（变阻器/rheostat 功能），并且是毒力所必需；非极性 espZ 缺失突变体（ΔespZ）相较于野生型 EPEC 会导致上皮细胞死亡增加。EspZ 具有两个预测跨膜（transmembrane，TM）结构域，中间由 8–10 个氨基酸环区隔开。为系统解析 EspZ 功能结构域，研究人员构建了质粒编码变异体（pM1–pM16），依次替换蛋白中 3–5 个氨基酸块，并评估其互补 ΔespZ 的能力。三个区域改变（M4：37GTSRSV42→37AAAAAA42；M12：74LGLGI78→74AVAAA78；M13：81GVLGG85→81VAAAV85）损害 ΔespZ 的细胞保护互补能力。M4 与 M13 改变（而非 M12）消除 EspZ 分泌。转染上皮细胞中异位表达 M4 变异体（而非 M12 与 M13）可防护 ΔespZ 感染导致的高死亡。M12 变异体在 rheostat 功能上与野生型 EspZ 相当，提示 EspZ 具有 rheostat 非依赖的细胞保护功能。M12 与 M13 改变与串联 GXXXG（甘氨酸拉链/glycine zipper）基序重叠，该基序已知促进同源与异源蛋白互作。ToxLuc 实验确认 EspZ TM2 定位于膜并促进同源互作，靶向改变甘氨酸拉链可消除自结合。综上，数据表明两个内部序列（M4、M13）参与 EspZ 分泌，确认 TM1 与 TM2 膜定位，并将 TM2 甘氨酸拉链与 EspZ 自结合及宿主细胞保护联系起来。

研究背景方面，肠致病性大肠杆菌（EPEC）是幼龄腹泻性疾病与死亡的主要病原，属于附着擦除（attaching and effacing，A/E）病原，依靠 locus of enterocyte effacement（LEE）编码的 III 型分泌系统（T3SS）向肠上皮细胞注入效应蛋白。EspZ 是感染早期分泌、约 98 个氨基酸的效应蛋白，对 A/E 病原毒力至关重要；已有研究提示其通过限制效应蛋白转位（rheostat 功能）以及与 CD98、TIM17B、FIS1 等宿主蛋白互作来延迟感染肠上皮细胞死亡。但 EspZ 与数据库其他蛋白无显著序列相似性，其功能结构域长期未被系统界定；N 端前 21 个氨基酸负责 T3SS 分泌，两个预测跨膜区（TM1、TM2）及中间环区虽被描述，但哪些残基决定分泌、细胞保护与 rheostat 功能仍不清楚。由于 EPEC 腹泻治疗选择有限且无获批疫苗，解析 EspZ 功能结构域对理解致病机制具有重要价值，因此研究人员在《Microbiology Spectrum》发表该研究，系统绘制 EspZ 功能图谱。

关键技术方法方面，研究人员以 EPEC E2348/69 与同基因非极性 ΔespZ 为模型，构建低拷贝质粒编码的 16 个扫描突变体 pM1–pM16 进行互补筛选；用 TEM1-β-内酰胺酶/CCF2-AM 荧光共振能量转移（FRET）报告系统评估效应蛋白转位与 rheostat 功能；用碘化丙啶（PI）摄取与乳酸脱氢酶（LDH）释放评估宿主细胞死亡；将选定 espZ 等位基因克隆至真核表达载体进行 HeLa 细胞异位表达以绕开分泌缺陷；采用 ToxR-TM-MBP 融合的 ToxLuc 系统在 ΔmalE 大肠杆菌中验证跨膜区膜定位与二聚化/寡聚化。

低拷贝质粒互补恢复 EspZ 缺失突变体的效应转位调控与宿主存活保护：研究人员用兼容质粒表达 TEM1 β- lactamase 转位报告蛋白，证实 ΔespZ 转位增强，低拷贝 pWT 可恢复 rheostat 功能；PI 与 LDH 实验显示 pWT 也逆转 ΔespZ 导致的上皮细胞高死亡，半定量 RT-PCR 证明转录水平相当，说明该系统适合功能域筛选。

鉴定分泌与细胞保护关键残基：研究人员构建 pM1–pM16 并感染 C2BBe 细胞，发现 M4、M12、M13 不能抑制 ΔespZ 增高细胞毒性；分泌实验显示 M4 与 M13 变异体蛋白不入上清，M12 仍可分泌；HeLa 异位表达实验表明 M4 仍具保护作用，而 M12 与 M13 即使进入宿主细胞也不能保护，说明 M12/M13 对应 TM2 序列是限制感染细胞死亡的关键。

EspZ rheostat 功能可与宿主保护功能分离：研究人员将 pSR1 报告质粒转入 ΔespZ/pWT 与 ΔespZ/pM12，发现 M12 完全恢复 rheostat 功能却不能恢复细胞保护，说明 ⁷⁴LGLGI⁷⁸ 具有不依赖效应蛋白转位限制的宿主保护功能，也排除 M12 为整体结构破坏所致。

EspZ TM2 靶向膜并促进自结合：研究人员将 EPEC-TM1、EPEC-TM2 及 TM2 突变体装入 pTL 做 ToxR-TM-MBP 融合，在 ΔmalE 菌株中以麦芽糖唯一碳源验证膜定位；ToxLuc 显示 TM2（非 TM1）诱导荧光素酶活性，TM2-G81L、TM2-G85L 与 Triple 突变消除自结合，TM2-G77L 仍保留，表明 TM2 甘氨酸拉链中 G⁸¹ 与 G⁸⁵ 对 EspZ 寡聚化关键。

讨论部分总结：研究人员指出 EspZ 虽仅 98 个氨基酸却是 A/E 病原核心效应蛋白；N 端 21 aa 足以分泌，M4 与 M13 分泌缺陷可能关联 CesT 扩展基序或伴侣互作，M5/M6 虽能互补细胞保护但效率下降也支持该线索。TM1 与 TM2 均可将异源 MBP 锚定膜上，与 EspZ 以发夹方式插入宿主膜、N/C 端朝胞质一致；环区有限突变仍具保护但效率降低，与既往环区调控种特异性 rheostat 的结果相符。TM1 含单个 GXXXG，TM2 含串联 GXXXGXXXG；本研究显示仅 TM2 促寡聚化，G⁷⁷IAA G⁸¹VLG G⁸⁵ 中第 2、3 个甘氨酸及上游 M12 序列环境对自结合重要。该甘氨酸拉链可能通过和 TIM17B、CD98、FIS1 等含 GXXXG/AXXXA 的宿主膜蛋白互作，介导线粒体稳态与抗死亡；也可能影响膜微区定位。研究结论表明：EspZ 跨膜区定位于膜，M4 与 M13 为分泌必需，TM2 甘氨酸拉链驱动自结合并支撑 rheostat 非依赖的细胞保护，EspZ 除限制其他效应蛋白转位外，还存在直接宿主互作保护通路，为后续体内定点突变与毒力研究奠定基础。