《Microbiology Spectrum》：Biofilm formation and multispecies interactions of bacteria recovered from drinking water systems in broiler houses and piglet nursery units
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畜禽舍饮水系统（drinking water systems, DWS）表面的生物被膜可损害饮水的微生物质量。因此，了解生物被膜微生物组及其优势菌种的生物被膜形成能力至关重要，特别是识别那些通过相互作用共存并增强生物被膜形成的菌种。本研究调查了从肉鸡舍和仔猪保
畜禽舍饮水系统（drinking water systems, DWS）表面的生物被膜可损害饮水的微生物质量。因此，了解生物被膜微生物组及其优势菌种的生物被膜形成能力至关重要，特别是识别那些通过相互作用共存并增强生物被膜形成的菌种。本研究调查了从肉鸡舍和仔猪保育单元饮水系统采集的生物被膜样本中代表优势微生物群的248株细菌分离株。在单菌种培养和341个多菌种组合中评估了生物被膜形成能力。在所测分离株中，80%在单菌种培养中形成生物被膜；然而，仅25%被归类为强生物被膜形成菌。在多达四种菌种或分离株的多菌种组合中，拮抗或竞争性相互作用占主导，而仅在有限数量的组合中观察到生物被膜量增强。这些组合包括机会致病菌，其中弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）和尼泊尔葡萄球菌（Staphylococcus nepalensis）被确定为驱动相互作用的关键菌种。研究人员的研究强调了特定微生物相互作用在生物被膜发育中的重要性，并提供了一个具有潜在实践相关性的四菌种模型，以指导未来旨在改进畜禽饮水系统中生物被膜控制策略的研究。
**论文解读：肉鸡舍和仔猪保育单元饮水系统生物被膜细菌的多物种互作研究**
**研究背景与意义**
生物被膜是微生物群落包裹在自产或共享的胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质中的聚集体，广泛存在于饮水系统（drinking water systems, DWS）表面，会损害饮水微生物质量，并对人和动物构成健康风险。全球范围内，生物被膜失控在医疗、家庭护理、食品工业及畜禽养殖领域每年造成数十亿美元的经济损失。现有畜禽养殖业的生物被膜控制策略主要依赖机械/化学清洁与消毒，但生物被膜常在清洁消毒后持续存在，且其中可能含有机会致病菌。因此，理解DWS生物被膜的微生物组成及物种间相互作用，对于制定靶向监测和控制策略至关重要。此前研究已鉴定肉鸡舍和仔猪保育单元DWS生物被膜中优势菌属为葡萄球菌属和假单胞菌属，但种间互作尚未被系统研究。本研究旨在表征从DWS生物被膜中分离的细菌单菌种生物被膜形成能力，并通过多菌种组合筛选通过相互作用共存并增强生物被膜的关键菌种，从而为建立标准化多菌种生物被膜模型提供依据。该论文发表在《Microbiology Spectrum》。
**研究设计与技术方法**
研究人员从比利时佛兰德斯地区15个肉鸡舍和15个仔猪保育单元（使用地下水、地表水、雨水或自来水）的DWS管道内表面，于生产周期结束、清洁消毒前采集生物被膜样本。基于此前研究中各农场优势菌种的鉴定结果，选取248株代表分离株（肉鸡舍128株、仔猪单元120株），涵盖26属53种和26属49种。采用96孔聚苯乙烯微孔板结晶紫染色法，在25°C（模拟DWS平均水温）下定量单菌种生物被膜形成能力，并据吸光度值划分为非、弱、中、强形成菌。选取29个常见优势种构建全部可能的四菌种组合（共341个），以混合生物被膜吸光度与各单菌吸光度之和的比值判定协同（>1）或拮抗（<1）。对疑似协同组合重复验证，并进一步测试协同组合中所有二菌和三菌组合。利用扫描电子显微镜（SEM）观察不锈钢表面生物被膜形态。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Fisher精确检验（FDR校正，q<0.05）。
**研究结果**
**1. 单菌种生物被膜形成**
通过结晶紫染色定量248株分离株，约80%能在单菌种培养中形成生物被膜，但仅25%为强形成菌。肉鸡舍强形成菌比例（20%）低于仔猪单元（29%）。肉鸡舍中主要强形成菌为嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）和短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）；仔猪单元则以葡萄球菌属（包括S. nepalensis、S. saprophyticus、S. epidermidis）为主，另有B. diminuta、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和Psychrobacter pulmonis。所有分离株中，来自仔猪单元的一株表皮葡萄球菌（S. epidermidis）生物被膜形成能力最强。
**2. 多菌种生物被膜互作**
在341个四菌种组合中，仅15个（4%）表现出协同或正相互作用，即混合生物被膜量显著高于各单菌生物被膜量之和（P<0.05）。其中13个来自仔猪单元，2个来自肉鸡舍；11个组合的生物被膜量增加超过1.2倍。结果表明，多菌种群落中拮抗或中性互作占绝对主导，协同增效仅出现在极少数特定组合中。
**3. 参与互作的特定细菌**
针对协同组合的SEM观察显示，仔猪单元中协同组合常包含尼泊尔葡萄球菌（S. nepalensis），且在与Microbacterium paraoxydans、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、Aerococcus viridans等组合时，不锈钢表面生物被膜覆盖度显著高于单菌。肉鸡舍最强的协同组合由B. diminuta、Acidovorax delafieldii、Pseudacidovorax intermedius和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）构成，混合生物被膜覆盖度显著增加，但因均为杆状菌，形态上无法区分各菌种。
**4. 塑造互作的关键菌种**
基于Fisher精确检验（FDR校正，q<0.05），C. freundii（P=0.0009, q=0.0128）和S. nepalensis（P=0.0001, q=0.0028）被确定为驱动四菌种组合协同互作的关键菌种，两者均仅见于仔猪单元。在二菌和三菌组合中，C. freundii仍是唯一关键菌种（二菌：P=0.0004, q=0.0067；三菌：P=0.0003, q=0.0050）。这些关键菌种与S. epidermidis、M. paraoxydans、P. pulmonis、A. viridans、S. maltophilia和P. aeruginosa等相互作用。
**讨论与结论**
讨论部分指出，尽管培养基营养丰富，但96%的四菌种组合未表现出协同增效，表明生物被膜形成并不仅仅由营养可利用性驱动，而常是对生物或非生物胁迫的响应，且高度依赖于特定物种组合。实验室系统难以完全模拟自然环境的复杂性（如不可培养微生物的存在）。关键菌种C. freundii为革兰阴性肠杆菌科细菌，常见于污水、食物及猪肠道，与多重耐药相关；S. nepalensis为凝固酶阴性葡萄球菌，可作机会致病菌。两者与优势生物被膜成员互作，显著增强生物被膜量。此外，低丰度物种虽未在统计上鉴定为关键菌种，但可能对维持生物被膜结构和功能具有生态学意义。
研究结论翻译：畜禽DWS中的生物被膜含有多种细菌群落，其持久性受内在生物被膜形成能力和种间互作共同影响。利用代表肉鸡舍和仔猪保育单元优势菌群的分离株，本研究表明大多数分离株在单菌种培养中能形成生物被膜，但仅25%为强形成菌。在混合群落中，拮抗或中性结果占主导，仅在少数四菌种组合中观察到协同增效，且仔猪源组合多于肉鸡源组合。协同群落常含机会致病菌，其中C. freundii和S. nepalensis在组合中显著富集，且C. freundii在低阶（二菌和三菌）互作中重复出现。这些发现强调，在实验室条件下，尤其是营养丰富的培养基中，DWS表面强生物被膜的形成常受竞争性互作制约，而这些条件不能完全反映DWS中营养有限的实际环境。然而，协同生物被膜形成可在特定群落背景下可重复出现，提示自然环境中的微生物互作可能发生在特定的相容物种组合中。未来工作应在真实DWS条件（如低碳水基质、水流、温度波动和清洁/消毒制度）下评估这些相互作用，并利用协同菌种组合作为合成模型系统，制定靶向策略以限制DWS表面的生物被膜形成和持久性。
