放线菌生物表面活性剂对核桃黄单胞菌核桃致病亚种（Xanthomonas arboricola pv. juglandis）菌株生物膜形成的生物活性

《Applied Microbiology》：Biological Activity of Actinobacterial Biosurfactants Towards Biofim Formation by Xanthomonas arboricola pv. juglandis Strains

　　

本研究评估了Streptomyces lavendulae subsp. lavendulae 214菌株的脂肽（lipopeptide）和Streptomyces griseoflavus 2265菌株的氨基糖脂（aminoglycolipid）生物表面活性剂对Xanthomonas菌株生物膜形成的抗生物膜活性。在最低浓度为40 mg/L时，Streptomyces griseoflavus 2265和Streptomyces lavendulae subsp. lavendulae 214菌株的生物表面活性剂对Xanthomonas arboricola pv. juglandis 2417菌株及其突变菌株的生物膜发育表现出抗生物膜活性。利用傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）和核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）鉴定了所分离生物表面活性剂的结构。Xanthomonas arboricola pv. juglandis 8636菌株rpfA基因的突变及Xanthomonas arboricola pv. juglandis 8737菌株rpfGC遗传片段缺失，未能确保其对放线菌菌株分泌的抗微生物剂作用产生抗性。Streptomyces griseoflavus 2265菌株氨基糖脂生物表面活性剂浓度高达20 mg/L及Streptomyces lavendulae subsp. lavendulae 214菌株脂肽生物表面活性剂浓度高达10 mg/L时，刺激了Xanthomonas arboricola pv. juglandis菌株的细胞运动性，而浓度进一步升高则伴随运动性抑制，该抑制不受Xanthomonas arboricola pv. juglandis 8636菌株rpfA基因突变及Xanthomonas arboricola pv. juglandis 8737菌株rpfGC遗传片段缺失的影响。这些结果可为理解以放线菌为主的土壤微生物产生的生物表面活性剂对不同基因型Xanthomonas arboricola pv. juglandis菌株在农作物上的发育和传播的拮抗效应提供基础信息。

**放线菌生物表面活性剂对核桃黄单胞菌核桃致病亚种菌株生物膜形成的抑制作用研究解读**

**1. 研究背景与科学问题**

植物病原黄单胞菌（Xanthomonas）属细菌可侵染多种经济作物，引起维管束病害、叶斑病、黑腐病等严重病害，造成重大农业经济损失。其致病性依赖于多种毒力因子，包括胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）合成、植物细胞壁降解酶的分泌以及在植物表面形成抗性生物膜的能力。生物膜的形成是黄单胞菌侵染过程的早期关键步骤，可保护菌体免受外界环境胁迫和抗微生物剂的攻击。黄单胞菌的群体感应信号分子DSF（cis-11-methyl-2-dodecenoic acid）调控胞外多糖和诱导酶的生物合成，而rpf基因级联在调控细胞壁降解酶分泌和生物膜形成中发挥核心作用。此外，σ因子RpoN与鞭毛合成、运动性和氧化胁迫响应密切相关。

近年来，微生物源生物表面活性剂因其低毒、可生物降解且具有抗生物膜活性而受到关注。放线菌（Actinobacteria）是土壤中重要的生物表面活性剂产生菌，其产生的脂肽和糖脂类化合物可通过破坏细胞膜、抑制生物膜形成、干扰群体感应等机制发挥抗菌作用。然而，关于放线菌生物表面活性剂对黄单胞菌，尤其是对核桃黄单胞菌核桃致病亚种（Xanthomonas arboricola pv. juglandis）不同基因型菌株的生物膜形成和毒力调控的影响，现有文献报道甚少。因此，研究人员开展本研究，旨在评价两株链霉菌产生的生物表面活性剂对三株X. arboricola pv. juglandis（包括两个rpf基因突变株）的抗生物膜和抗毒力效应，并利用FTIR和NMR进行结构鉴定，为开发基于放线菌生物表面活性剂的植物病害防控策略提供理论依据。

**2. 主要技术方法**

研究人员采用柱色谱法从Streptomyces griseoflavus 2265和Streptomyces lavendulae subsp. lavendulae 214菌株的培养物中纯化生物表面活性剂，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）鉴定其化学结构。通过三亲本接合转移构建X. arboricola pv. juglandis 8636（rpfA）单突变株和X. arboricola pv. juglandis 8737（rpfGC）双突变株。采用结晶紫染色法评价生物膜形成量，通过琼脂平板运动性实验检测细胞运动能力，利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察生物膜结构，采用乙醇沉淀法测定胞外多糖含量，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析鞭毛、趋化、胞外酶等相关基因的表达水平，并利用罗勒叶片划伤接种法评价病原菌的致病力。所有实验均设三次重复，数据采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计检验。

**3. 研究结果**

**3.1 生物表面活性剂的结构鉴定**

FTIR分析显示，S. griseoflavus 2265菌株产生的生物表面活性剂在3300–3400 cm^?1处出现O–H和N–H伸缩振动宽峰，在~2928 cm^?1和~2856 cm^?1处出现亚甲基C–H不对称和对称伸缩峰，~1743 cm^?1处尖锐强峰为酯羰基C=O伸缩振动，1014–1157 cm^?1处强宽峰归属于C–O–C和C–O–H的糖苷键振动，表明其为氨基糖脂类生物表面活性剂。¹H NMR和¹³C NMR进一步证实存在长脂肪链、羧酸/酯基和与天冬氨酸/谷氨酸残基结合的甲氧基。S. lavendulae subsp. lavendulae 214菌株产生的生物表面活性剂FTIR谱图显示3300–3400 cm^?1（N–H伸缩）、1650–1744 cm^?1（CO–N伸缩）、1520–1550 cm^?1（肽键弯曲）等特征峰，¹H NMR在7.5–7.2 ppm出现肽骨架N–H信号，5.5 ppm处检测到酯羰基（内酯环），0.97–0.81 ppm处为脂肪酸末端分支-CH(CH₃)₂信号，确认其为脂肽类生物表面活性剂。

**3.2 生物表面活性剂对生物膜形成的影响**

随着S. griseoflavus 2265氨基糖脂和S. lavendulae subsp. lavendulae 214脂肽浓度从10 mg/L增加至50 mg/L，三株X. arboricola pv. juglandis菌株的生物膜形成量均显著降低，其中S. griseoflavus 2265菌株生物表面活性剂的最低抑制浓度为30 mg/L，且在40 mg/L浓度下对Xanthomonas spp. 8636菌株生物膜形成的抑制效果最强。X. arboricola pv. juglandis 2417野生型菌株表现出相对最强的抗性，其生物膜光密度（OD₅₄₀）在50 mg/L脂肽和氨基糖脂作用下分别从0.44±0.25降至0.25±0.06和0.26±0.19。

**3.3 生物表面活性剂对细胞运动性的影响**

低浓度（10–20 mg/L）生物表面活性剂可刺激黄单胞菌的运动性，而高浓度（40 mg/L及以上）则完全抑制细胞运动。S. griseoflavus 2265氨基糖脂在40 mg/L时使rpfA突变株8636的运动圈直径降至1.1±0.57 mm，而S. lavendulae subsp. lavendulae 214脂肽在40 mg/L时使野生型2417的运动圈直径降至0.75±0.15 mm。rpfGC缺失突变株8737在20 μg/L（原文如此，应为mg/L）生物表面活性剂浓度下运动圈直径反而增大至2.35±0.91 mm，随后随浓度增加而下降。rpfA和rpfGC突变并未赋予菌株对生物表面活性剂运动抑制作用的抗性。

**3.4 生物表面活性剂对胞外多糖合成的影响**

在10–20 mg/L低浓度生物表面活性剂存在下，黄单胞菌的胞外多糖合成被刺激，X. arboricola pv. juglandis 2417在20 mg/L S. griseoflavus 2265氨基糖脂条件下EPS含量达0.2 g/10⁵ CFU；随浓度升高至50 mg/L，EPS含量降至0.045 g/10⁵ CFU。rpfA突变株8636和rpfGC缺失株8737在20 mg/L氨基糖脂下EPS积累量高于野生型。在S. lavendulae subsp. lavendulae 214脂肽作用下，三株菌EPS产量随浓度升高而直接下降，50 mg/L时rpfA突变株EPS降至0.08 g/10⁵ CFU。

**3.5 基因表达分析**

qRT-PCR结果显示，40 mg/L生物表面活性剂处理显著降低了黄单胞菌鞭毛合成相关基因（motA、motB、flgA、flgE）、趋化基因（cheY、cheD）、菌毛基因（pilA）以及胞外多糖合成基因（gumC）的转录水平。rpfGC缺失株在生物表面活性剂作用下酯酶和脂肪酶基因活性降低，但其生物膜分布面积仍保持较高水平，表现出一定的抗性。

**3.6 致病力测定**

在罗勒叶片划伤接种实验中，40 mg/L生物表面活性剂处理显著减小了X. arboricola pv. juglandis菌株引起的褪绿斑面积，这与细胞壁降解酶活性受到抑制及运动性、趋化性相关基因表达下调有关。rpfA和rpfGC突变不影响生物表面活性剂对病斑面积的减小效应。

**4. 讨论与结论**

研究人员通过FTIR和NMR表征确认了S. griseoflavus 2265产生氨基糖脂、S. lavendulae subsp. lavendulae 214产生脂肽类生物表面活性剂。这两种化合物在40 mg/L最低浓度下可通过抑制细胞运动、胞外多糖生物合成和致病相关基因表达，有效抑制X. arboricola pv. juglandis野生株和rpf突变株的生物膜形成，并降低其在罗勒叶片上的致病力。rpfA基因突变和rpfGC片段缺失均未使菌株对生物表面活性剂产生抗性，表明该类化合物的抗菌机制可能作用于更基础的细胞过程。研究结论指出，放线菌生物表面活性剂在极低浓度下即表现出抗生物膜和抗微生物活性，且其产生菌可利用工业废弃物进行培养，具有生产成本低和环境友好的优势。然而，将其应用于田间植物保护仍需进一步研究其作用机制、广谱性和田间条件下的实际效果。本研究为利用放线菌生物表面活性剂防控黄单胞菌引起的作物病害提供了重要的理论基础和潜在候选化合物。