智利科查莫山谷热泉土壤来源的Brevibacillus borstelensis菌株BB2草图基因组

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genome sequence of Brevibacillus borstelensis strain BB2 isolated from a hot spring in the Cochamó Valley, Chile

　　

摘要

Brevibacillus borstelensis菌株BB2是从智利科查莫山谷采集的土壤样本中分离得到的。该草图基因组由187条contigs组成，总大小为5.25 Mb，鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量为51.7%。在MGI DNBSeq-G400平台上进行测序，产生了3,406,660条双端 reads，提供了约170×的覆盖度，用于基因组资源报告。

公告

Brevibacillus borstelensis是一种嗜热、形成芽孢、革兰氏阳性细菌，通常从土壤和极端环境（如温泉）中分离得到（1，2）。菌株BB2来自在智利科查莫山谷拉伦温泉采集的土壤样本（41°21′40.3″S，72°19′48.4″W；WGS84），该区域受火山活动影响。B. borstelensis成员中来自地热环境的菌株在生物技术领域具有研究价值，此前的工作已对该物种的热应激反应进行了表征（1，3，4），但基因组资源仍然稀缺。对菌株BB2进行测序弥补了这一空白，并为识别其适应温泉栖息地相关基因奠定了基础。基因组注释揭示了编码脂肪酶/脂酶、铁载体相关功能、应激反应机制和芽孢形成相关系统的基因的存在，为该菌株的环境持久性和生理特性提供了相关的基因组信息（3，4）。

土壤样本使用无菌工具在10 cm深度处采集，并保存于4°C直至处理。为分离活细菌菌株，将等份样本悬浮于无菌0.9% NaCl中，并进行梯度稀释后涂布于LB/3琼脂平板（成分：酵母浸粉1.7 g/L；NaCl 3.3 g/L；蛋白胨3.3 g/L；琼脂20 g/L），于50°C培养24小时。具有短芽孢杆菌属形态的菌落通过反复划线纯化，并在含20%甘油的培养基中于?80°C冷冻保存。在相同条件下，取单个菌落在LB/3琼脂培养基中培养，用于基因组DNA提取。按照制造商说明使用GeneJET Genomic DNA Purification Kit（Thermo Fisher）提取总基因组DNA。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit在Qubit 4.0荧光计上对DNA进行荧光定量。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳确认DNA完整性。

从100 ng基因组DNA出发，使用MGIEasy FS DNA Library Prep Set（MGI Tech）按照标准方案进行文库制备。连接接头、修复DNA末端、环化片段并合成DNA纳米球（DNBs），然后上机测序。测序在DNBSeq-G400平台（MGI Tech）上使用DNBSeq PE150配置进行，共产生3,406,660条双端 reads（2 × 150 bp），对应约6 Mb基因组的约170×覆盖度。测序使用了FCL流动池芯片（PE150配置，四条泳道，每泳道约4亿条 reads）；BB2被加载到第2泳道。DNB加载时标准化至1 pM的最终池浓度，BB2加载了2.18 ng的PCR产物（目标约300万条 reads，占该泳道产量的0.75%）。ssDNA文库调节至40 fmol/μL，25 μL的DNB制备物被加载到流动池芯片上。碱基识别使用DNBSeq-G400的标准集成采集/处理软件（MGI Tech），生成FASTQ文件。使用FastQC v0.12.1以默认参数评估 reads质量（5），使用Fastp v0.23.4在两种严格水平（Q28和Q30）下进行接头修剪和过滤（--detect_adapter_for_pe --trim_poly_g --overrepresentation_analysis --trim_poly_x --low_complexity_filter --correction --thread 16 --trim_front1 13 --trim_front2 13 --trim_tail1 0 --trim_tail2 0 --cut_tail --cut_window_size 4 --cut_mean_quality 30 --average_qual 28 | 30）。保留Q30数据集用于后续组装。

使用SPAdes v3.15.5（--threads 24—memory 120 –-careful）进行de novo组装（6）；排除短于500 bp的contigs；最终组装由187条contigs组成，总长5,252,178 bp，N50为78,784 bp。使用QUAST v5.3.0以默认参数评估组装质量（7），同时检测了全长rRNA操纵子。使用RagTag v2.1.0以默认参数进行支架优化，以Brevibacillus borstelensis CP144922为参考，可分离染色体和潜在质粒片段。使用CheckM1 v1.2.5以默认参数估算基因组完整性和污染（8），结果显示完整性>91.02%，污染为7.66%。

使用原核基因组注释流程（PGAP）（V6.10，默认美国国家生物技术信息中心[NCBI]参数，方法：最佳放置参考蛋白集；GeneMarkS-2+）进行基因组注释（9），识别出5,035个CDS、6个rRNA、59个tRNA、5个ncRNA、79个假基因、2个CRISPR阵列和一个oriC。组装由187条contigs组成，总长5,247,696 bp，GC含量51.74%，N50为78,784 bp，N90为17,420 bp，无缺口（N = 0），编码密度为86.3%。功能注释（eggNOG-mapper v2.1.9，默认参数）（10）将基因分配到25个COG类别中，以S类（25.9%）、E类（10.7%）和K类（10.3%）为主。还检测到与芽孢形成、应激反应、杆菌替硫醇生物合成、铁载体产生/转运、β-内酰胺酶、多重耐药以及多种脂肪酶/脂酶相关的基因，支持了Brevibacillus borstelensis BB2的生态适应性。

致谢

本工作由智利政府ANID FONDECYT Regular基金第1231917号（A.G.、A.B.）以及ANID/BASAL/FB210008和Programa de Mejoramiento Académico（F.I.）资助。