基于免疫原性细胞死亡的口腔鳞状细胞癌预后标志物及靶向治疗研究

《Current Proteomics》：Research on prognostic markers and targeted therapy for oral squamous cell carcinoma based on immunogenic cell death

　　

基于免疫原性细胞死亡(ICD)，CTLA4、TNFRSF4和CD5被鉴定为口腔鳞状细胞癌(OSCC)的核心预后标志物。所构建的ICD相关预后风险模型能够将OSCC患者显著分为不同的风险组。三个核心预后基因在T细胞中显著表达。化合物1(Compound 1)对TNFRSF4表现出优异的靶向结合活性。化合物1可通过靶向TNFRSF4激活CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫。

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部鳞状细胞癌中最常见的亚型，具有侵袭性强、复发和转移率高、预后差等特点。目前主要治疗手段为手术切除联合放化疗，但对于中晚期患者，常规治疗效果受限，易出现耐药和严重毒副作用。近年来免疫治疗虽为恶性肿瘤治疗带来突破，但仅少数OSCC患者从中获益，核心原因在于其复杂的免疫微环境缺乏有效的免疫治疗靶点和预后评估指标。免疫原性细胞死亡（ICD）作为一种独特的细胞死亡方式，与凋亡和坏死不同，它能促使濒死肿瘤细胞释放损伤相关分子模式（DAMPs），如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、ATP和钙网蛋白（CRT），进而招募和激活树突状细胞等抗原提呈细胞，触发特异性适应性免疫应答，并促进CD8⁺ T细胞等效应免疫细胞浸润肿瘤部位发挥细胞毒作用。ICD相关基因（ICDRGs）的表达特征与肿瘤免疫微环境、治疗反应和患者预后密切相关。基于ICDRGs构建的预后模型已在尿路上皮癌、结直肠癌和乳腺癌等肿瘤中获得验证，但在OSCC中，ICDRGs的筛选、预后模型构建及靶向ICD的免疫治疗策略仍缺乏系统性研究。高通量转录组测序技术能够在全基因组水平分析肿瘤与正常组织的基因表达差异，为筛选关键基因和预后标志物提供了高效手段；单细胞转录组测序技术则进一步克服了传统测序的局限，可在单细胞水平解析肿瘤微环境中不同细胞亚群的基因表达特征，为明确关键基因的细胞定位和调控作用提供更精准的技术支持。基于此，本研究以ICDRGs为切入点，整合转录组测序、单细胞测序及公共数据库临床信息，通过生物信息学分析筛选OSCC中ICD相关的差异表达基因，构建基于ICD的预后风险模型，鉴定核心预后标志物，并结合单细胞转录组分析和免疫组织化学（IHC）验证，探索靶向核心标志物的潜在免疫治疗药物及其作用机制，旨在为OSCC的预后评估提供新指标，为免疫增敏治疗发现新靶点和策略。

研究人员从癌症基因组图谱（TCGA）数据库下载头颈鳞状细胞癌转录组测序数据及对应临床信息，依据解剖部位筛选出口腔、颊黏膜、唇、牙槽嵴、硬腭和口底的331例癌组织样本及32例癌旁正常样本作为训练集；从基因表达综合（GEO）数据库获取GSE41613数据集（含97例OSCC患者的转录组表达谱和临床信息）作为验证集，以及GSE172577数据集（含6例OSCC患者的单细胞转录组测序数据）用于单细胞分析。根据既往文献整理出34个ICDRGs作为基因集。通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估所有样本的ICDRGs评分，并在肿瘤组织中观察到其显著升高。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选与ICDRGs评分最相关的关键模块；采用DESeq2筛选OSCC肿瘤与正常样本间的差异表达基因（DEGs），并与关键模块基因取交集获得DE-ICDRGs。对DE-ICDRGs进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。在训练集中依次采用单因素Cox回归、LASSO回归和多因素逐步Cox回归筛选核心预后基因并构建风险评分模型。在训练集和验证集中通过Kaplan-Meier（KM）生存曲线、时间依赖受试者工作特征（ROC）曲线评估模型效能。结合单细胞转录组数据解析核心基因的细胞定位，并利用临床样本IHC进行蛋白水平验证。通过药物-基因相互作用数据库（DGIdb）预测靶向核心基因的药物，并运用AutoDock Vina进行分子对接。体外实验中，分离健康人外周血单个核细胞（PBMCs）中的CD8⁺ T细胞，与OSCC细胞系SCC-4和SCC-25建立共培养体系，通过CCK-8、Western blot、酶联免疫吸附测定（ELISA）、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和流式细胞术评估候选药物对CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫的调控作用。

结果部分的主要发现包括：

（1）ICDRGs评分差异及WGCNA关键模块筛选：通过ssGSEA评分发现，TCGA-OSCC数据集中肿瘤样本的ICDRGs评分显著高于正常样本，提示ICD相关信号通路在OSCC中处于激活状态。WGCNA分析确定软阈值为10，构建无标度网络后共识别出多个基因模块，其中MEgreen模块与ICDRGs评分相关性最高（相关系数=0.76，p=9e-63），包含483个基因，被确定为关键模块。

（2）DE-ICDRGs筛选、PPI网络构建及功能富集分析：差异表达分析共鉴定出6012个DEGs（上调3029个，下调2983个）。DEGs与ICD相关关键模块基因取交集后获得76个DE-ICDRGs。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示这76个基因形成53个节点和225条相互作用对。GO富集分析显示这些基因主要富集在淋巴细胞增殖调控、单核细胞增殖调控、淋巴细胞活化正调控、白细胞介导免疫等生物学过程；KEGG通路富集显示其富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、破骨细胞分化、趋化因子信号通路等免疫相关通路，表明DE-ICDRGs主要通过调节机体免疫应答参与OSCC的发生发展。

（3）核心预后基因筛选：通过单因素Cox回归从76个DE-ICDRGs中初步筛选出11个与OSCC患者总生存期显著相关的基因；随后LASSO回归将变量压缩至8个；最终多因素逐步Cox回归结合HR<0.7且置信区间无重叠的标准，确定CTLA4、TNFRSF4和CD5为OSCC的核心预后基因，森林图显示三者均为保护性预后因素（HR<1），其高表达与患者良好预后相关。

（4）预后风险模型构建与验证：基于CTLA4、TNFRSF4和CD5的表达水平及回归系数构建风险评分模型。训练集中根据最佳截断值将患者分为高、低风险组，KM曲线显示高风险组总生存期显著缩短，风险曲线显示随风险评分增加死亡概率升高；1、2、3年ROC曲线的AUC分别为0.625、0.600和0.604。验证集GSE41613中同样显示高风险组预后较差，AUC分别为0.673、0.667和0.661，均大于0.6，证实模型具有良好稳定性。

（5）预后风险模型的临床相关性分析：风险评分在不同病理分级（1、2、3级）之间存在显著差异，分级越高风险评分越高。单因素Cox回归显示风险评分、年龄、病理分级和临床N分期是OSCC患者的独立预后因素。基于这四个因素构建的列线图（Nomogram）及其校准曲线显示预测1、2、3年生存率的校准曲线斜率均接近1，提示该模型具有较好的预测准确性。

（6）核心预后基因（CD5、CTLA4和TNFRSF4）的单细胞表达图谱：对GSE172577单细胞数据进行分析，共注释出B细胞、T细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肥大细胞五种细胞亚群。三个核心预后基因的表达信号高度集中于T细胞集群，提示它们可能通过调控T细胞功能参与OSCC免疫微环境调节，是潜在的免疫治疗靶点。

（7）CD5、CTLA4和TNFRSF4在OSCC组织中的差异表达：IHC染色结果显示，CD5在肿瘤组织中呈弥漫性强阳性，在癌旁组织中仅弱阳性；CTLA4阳性信号主要富集于癌旁组织，在肿瘤组织中低表达；TNFRSF4在癌旁组织广泛强阳性，在肿瘤组织中弱阳性。这些结果与转录组分析一致，在蛋白水平进一步证实了核心预后基因在OSCC组织与癌旁组织间的表达差异。

（8）靶向核心预后基因的药物预测及分子对接：DGIdb数据库预测分别有10种、30种和15种潜在药物靶向CD5、CTLA4和TNFRSF4。构建的药物-预后基因相互作用网络包含55个节点和53条边，其中化合物1（C1）为核心候选靶向TNFRSF4的药物。分子对接结果显示C1与TNFRSF4蛋白的结合能为-9.6 kcal/mol，二者之间形成多个氢键和疏水键，表明C1对TNFRSF4具有良好的结合活性，为靶向结合提供了结构基础。

（9）C1增强CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫：CCK-8实验表明，C1在0–50 μM浓度范围内对SCC-4和SCC-25细胞活力无明显影响，提示其无直接细胞毒性。在肿瘤细胞与CD8⁺ T细胞共培养体系中，C1处理可上调CD8⁺ T细胞中TNFRSF4蛋白表达；ELISA检测显示共培养上清中IFN-γ和颗粒酶B（GZMB）水平显著升高；LDH释放实验显示C1处理组肿瘤细胞杀伤率显著增加；流式细胞术检测显示C1处理可进一步提高肿瘤细胞凋亡率。以上结果证明C1可通过靶向TNFRSF4激活CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫，间接发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

讨论部分指出，本研究首次系统性鉴定了OSCC中基于ICD的核心预后基因，并构建了可有效区分不同风险患者的预后模型。CTLA4作为经典免疫检查点分子，在OSCC中低表达反映了肿瘤微环境的免疫抑制状态和免疫逃逸机制，而相对高表达患者预后较好，提示存在试图发起抗肿瘤免疫应答的活化T细胞亚群。TNFRSF4（OX40）是T细胞表面的共刺激分子，其与TNFSF4（OX40L）结合可激活下游信号通路，直接增强效应T细胞的增殖、存活和细胞毒能力，是抗肿瘤免疫应答的重要正性调节因子。其保护性预后特征为其作为免疫治疗靶点提供了直接依据。C1作为一种OX40小分子部分激动剂，具有组织穿透力强、稳定性好和制造成本低等优势，能够上调TNFRSF4表达并增强CD8⁺ T细胞功能，为“免疫增敏”策略提供了新思路。但研究仍存在局限性：生物信息学分析基于公共数据库，可能存在批次效应和种族差异；体外实验仅验证了C1对CD8⁺ T细胞的调控，尚需动物模型进行体内验证；缺乏基因敲低或中和抗体阻断等靶向机制验证，后续需利用基因敲除模型明确C1与TNFRSF4之间的因果关系。

研究结论部分可翻译为：总之，基于ICD，本研究确定了CTLA4、TNFRSF4和CD5作为OSCC的核心预后标志物；构建了能够有效评估OSCC患者预后风险的模型；确立了TNFRSF4作为OSCC免疫治疗的潜在靶点；并证明小分子C1能够通过特异性靶向TNFRSF4上调其表达，激活CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。这些发现为OSCC的预后评估和免疫增敏治疗提供了新工具和新策略，具有重要的临床转化潜力。