脂肪肉瘤功能基因鉴定与免疫细胞浸润分析

《PLOS One》：Identification of functional genes and immune cell infiltration analysis in liposarcoma

　　

摘要 脂肪肉瘤（Liposarcoma, LPS）是一种常见的软组织肉瘤，然而其分子发病机制和免疫细胞浸润情况仍知之甚少。本研究探讨了LPS中的潜在驱动基因和通路，并表征了免疫细胞浸润模式，以确定靶向治疗的潜在标志物。研究人员对LPS中的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）进行了基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。利用STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，并使用Cytoscape进行可视化。通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证了具有高|logFC|值的基因的mRNA表达水平。使用CIBERSORT算法量化了免疫细胞亚群。GO和KEGG分析揭示了显著的功能簇和通路，且大多数验证基因与生物信息学分析结果一致。生存分析显示，胸苷酸合成酶（TYMS）、驱动蛋白家族成员20A（KIF20A）、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶B（BUB1B）、核纤层蛋白B1（LMNB1）、核糖核苷酸还原酶调节亚基M2（RRM2）、ZW10相互作用动粒蛋白（ZWINT）和Rac GTP酶激活蛋白1（RACGAP1）的高表达与较差的总生存期（Overall Survival, OS）和无病生存期（Disease-Free Survival, DFS）显著相关。而胸腺素β15A（TMSB15A）、TPX2微管成核因子（TPX2）、丙酮酸激酶M1/2（PKM2）和PTTG1调控因子（PTTG1）的高表达仅与较差的DFS显著相关。CIBERSORT分析发现，与正常脂肪组织相比，LPS组织中静息肥大细胞（Mast Cells, MCs）的比例显著升高（P?<?0.05）。DNA拓扑异构酶IIα（TOP2A）、白细胞介素-6（IL-6）、增殖细胞核抗原（PCNA）、周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）、Jun原癌基因（JUN）、骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物（MYC）、周期蛋白B1（CCNB1）、表皮生长因子受体（EGFR）、乙酰辅酶A羧化酶β（ACACB）和杆状病毒IAP重复序列包含蛋白5（BIRC5）被确定为LPS的潜在诊断生物标志物，为核心基因研究提供了有力证据。免疫细胞浸润分析进一步表明，静息MCs可能在LPS发展中发挥潜在作用，尽管仍需进一步的实验验证。总之，这些发现阐明了LPS的分子基础，并为其未来治疗研究奠定了基础。

脂肪肉瘤功能基因与免疫微环境研究解读

一、研究背景与研究目的

脂肪肉瘤（Liposarcoma, LPS）是成人最常见的软组织肉瘤之一，约占所有软组织肉瘤的20%。根据2020年世界卫生组织（WHO）软组织肿瘤分类，LPS可分为五种组织学亚型：高分化型（Well-differentiated, WDLPS）、去分化型（De-differentiated, DDLPS）、黏液样型（Myxoid, MLPS）、多形性型（Pleomorphic, PLPS）和黏液样多形性型（Myxoid pleomorphic, MPLPS）。其中，WDLPS和DDLPS最为常见，其特征是染色体12q13-q22区域的扩增，该区域包含MDM2和CDK4基因。尽管手术切除是唯一的根治性手段，但对于晚期LPS患者常难以实施。此外，由于亚型间的异质性导致不同的生物学行为以及对放化疗的反应各异，使得治疗面临巨大挑战。因此，迫切需要阐明LPS发生发展的分子机制，并寻找有前景的治疗靶点。该研究旨在通过生物信息学分析，鉴定LPS的潜在驱动基因和关键信号通路，并分析其免疫细胞浸润特征，为靶向治疗提供潜在的分子标志物。该论文发表于《PLOS One》。

二、主要关键技术方法

研究人员首先从公共数据集GSE21122中获取基因表达谱数据，该数据集包含89例LPS组织和9例正常脂肪（Normal Fatty, NF）组织。采用RMA算法进行标准化处理，并通过limma包筛选差异表达基因（DEGs）。随后，利用DAVID数据库和clusterprofiler R包进行GO和KEGG通路富集分析。通过STRING数据库构建PPI网络，并使用Cytoscape软件进行可视化及模块分析，cytoHubba插件用于识别枢纽基因。为验证生物信息学分析结果，研究人员收集了来自山东省立医院的13例腹膜后LPS（RPLPS）组织和10例NF组织，通过RT-qPCR检测代表性DEGs的mRNA表达水平。利用GEPIA在线平台，基于TCGA和GTEx项目数据评估基因表达与肉瘤患者预后的关系。最后，采用CIBERSORT算法评估LPS和NF组织样本中22种免疫细胞的相对丰度，并分析枢纽基因与免疫细胞浸润的相关性。

三、研究结果

1. 差异表达基因的鉴定

从GSE21122数据集中共提取出855个DEGs，其中334个上调，521个下调。上调基因中|logFC|最高的包括胶原蛋白I型α1链（COL1A1）、CDC28蛋白激酶调节亚基2（CKS2）等；下调基因中|logFC|最高的是脂滴包被蛋白1（PLIN1）。

2. GO富集分析

GO分析显示，上调基因主要富集于非膜结合细胞器、细胞周期和有丝分裂细胞周期等生物学过程；下调基因则主要富集于质膜部分、胞外区、细胞凋亡调控和细胞增殖调控等功能簇。

3. 信号通路富集分析

KEGG分析表明，最显著的5条通路为细胞周期、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、HTLV-I感染、脂肪细胞中脂肪分解的调控和疟疾。上调基因高度富集于细胞周期、DNA复制等通路；下调基因则富集于流体剪切应力与动脉粥样硬化、cAMP信号通路等。HTLV-I感染是上下调基因的共同富集通路。

4. PPI网络与模块分析

PPI网络包含821个节点和7200条边。按节点度排名前10的枢纽基因为TOP2A、IL-6、PCNA、CDK1、JUN、MYC、CCNB1、EGFR、ACACB和BIRC5，被认为是LPS的潜在诊断生物标志物。从网络中筛选出两个重要模块：模块1（58个节点，1578条边）主要富集于细胞质和细胞内组分；模块2（7个节点，20条边）主要与运动和细胞迁移相关。

5. RT-qPCR验证

RT-qPCR验证结果显示，CKS2、RRM2、CCNB1、CDKN2A、MELK、PCNA、TOP2A、TTK和ZIC1在LPS组织中显著上调，而PLIN1、PPP1R1A、SAA1、CIDEC、HBB、CIDEA和PRKAR2B显著下调，与生物信息学分析结果一致。其中13个基因形成了两个小型调控网络，富集于细胞周期和p53信号通路。

6. 生存分析

生存分析显示，TYMS、KIF20A、BUB1B、LMNB1、RRM2、ZWINT和RACGAP1的高表达与肉瘤患者较差的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）均显著相关；而TMSB15A、TPX2、PKM2和PTTG1的高表达仅与较差的DFS显著相关。

7. 免疫细胞浸润分析

CIBERSORT分析显示，与NF组织相比，LPS组织中M2巨噬细胞是主要的免疫成分。差异分析表明，LPS组织中活化MCs、单核细胞和中性粒细胞显著减少，而初始B细胞、调节性T细胞（Tregs）和静息MCs显著增加。相关性分析发现，枢纽基因的表达与Tregs、M1巨噬细胞和静息自然杀伤（NK）细胞的浸润水平呈显著负相关，而与中性粒细胞、静息MCs、浆细胞和γδT细胞的丰度呈正相关。

四、讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出，RRM2在LPS中高表达且与不良预后相关，可能通过调控Akt/mTOR/4EBP1通路发挥作用。细胞周期通路是上调基因的主要富集通路，PCNA和CCNB1等细胞周期相关蛋白的相互作用值得关注。HTLV-I感染作为共同富集通路，可能通过激活宿主细胞癌基因参与肿瘤发生。PI3K-Akt通路在模块2中被富集，PTEN的下调可能使其成为DDLPS的潜在治疗靶点。TOP2A作为连接最多的枢纽基因，与其他癌症中的预后和治疗敏感性相关，其在LPS中的作用有待深入研究。MDM2和CDK4作为WDLPS和DDLPS的常见遗传标记，其抑制剂已在临床试验中显示出一定的疾病稳定效果，但客观缓解率不理想。对于MLPS，超过90%的病例携带特征性的FUS-DDIT3融合癌基因。

关于免疫微环境，研究人员提出静息MCs在LPS中显著增加，而活化MCs减少，提示MCs在LPS中可能发挥更强的抗肿瘤效应。他们假设MCs可能通过分泌促生长因子、营造免疫抑制微环境以及释放蛋白酶促进组织重塑等机制参与LPS进展，但具体作用（促肿瘤或抗肿瘤）可能依赖于具体情境，需进一步通过免疫组化和临床前模型验证。此外，ACACB与静息MCs的正相关以及JUN与活化MCs的正相关，提示LPS肿瘤微环境可能存在一种代谢独特的低炎症状态，有利于维持MCs的静息表型。

研究结论翻译：总之，本研究鉴定了可能与LPS发生发展相关的多种DEGs，免疫细胞浸润分析提示静息MCs可能在LPS的发生发展中发挥潜在作用，尽管仍需进一步的实验验证。这些发现揭示了LPS的潜在发病机制，并为未来的研究提供了有价值的见解。然而，需要进一步的验证来确认这些结果。