《PLOS One》：Integrative network analysis identifies candidate genes shared between ferroptosis and cuproptosis pathways in rheumatoid arthritis pathogenesis
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类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，以滑膜炎症、进行性关节破坏和全身免疫失调为特征。近期研究提示，金属稳态紊乱和调节性细胞死亡通路（包括铁死亡（ferroptosis，铁依赖性脂质过氧化）和铜死亡（cuproptosis，铜依赖性线粒体蛋白毒性
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，以滑膜炎症、进行性关节破坏和全身免疫失调为特征。近期研究提示，金属稳态紊乱和调节性细胞死亡通路（包括铁死亡（ferroptosis，铁依赖性脂质过氧化）和铜死亡（cuproptosis，铜依赖性线粒体蛋白毒性应激））参与RA发病机制。在本研究中，研究人员采用整合生物信息学方法，结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）、差异表达分析、功能富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建和免疫细胞浸润反卷积，以识别RA中关键的金属依赖性细胞死亡调控因子。利用来自15例健康对照和9例活动期RA患者（DAS28 > 2.7）外周血CD14+单核细胞的批量RNA-seq数据（GSE294225），研究人员鉴定出1,410个显著差异表达基因（DEGs）（校正后P < 0.05，log2倍数变化 > 1）。WGCNA揭示了一个与RA相关的模块，该模块富集于氧化应激、线粒体功能障碍和细胞死亡通路。铁死亡和铜死亡相关基因集的交集分析筛选出三个上调的枢纽基因，包括FTH1（铁蛋白重链1）、SOD2（超氧化物歧化酶2）和CDKN2A（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A），作为关键候选调控因子。这些基因表现出高模块成员度、在RA单核细胞中显著差异表达，并与免疫浸润模式显著相关，包括促炎性单核细胞/巨噬细胞增加和调节性T细胞减少。功能富集分析还突出了氧化应激反应、铁和铜稳态、线粒体呼吸和细胞衰老。单细胞分析进一步表明，这些枢纽基因主要在RA滑膜巨噬细胞和成纤维细胞中表达，这两种细胞是关节病理的主要介导者。综上所述，这些发现表明铁死亡相关通路与铜死亡相关通路之间可能存在关联，并提示FTH1、SOD2和CDKN2A是候选生物标志物和候选治疗靶点。
论文解读
一、研究背景与研究目的
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种慢性系统性自身免疫性炎症疾病，主要累及滑膜关节，导致进行性软骨和骨破坏、功能障碍及死亡风险增加。2019年全球患病率估计为1800万例，2021年全球年龄标准化发病率约为每10万人13.48例，且约70%的患者为女性。RA的发病机制极为复杂，涉及遗传易感性、吸烟和感染等环境触发因素，以及先天性和适应性免疫应答的失调，最终导致持续性滑膜炎症和关节外表现。成纤维样滑膜细胞（FLS）获得侵袭性肿瘤样表型，促进血管翳形成并分泌TNF-α和IL-6等促炎细胞因子；T细胞、B细胞、巨噬细胞和中性粒细胞浸润滑膜，通过产生类风湿因子和抗瓜氨酸化蛋白抗体等自身抗体维持促炎微环境。
近年来，多组学技术和生物信息学进展表明，非凋亡性调节性细胞死亡（RCD）通路可能在RA发病中发挥重要作用。铁死亡是一种铁依赖性细胞死亡形式，以脂质过氧化、谷胱甘肽耗竭和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活为特征；铜死亡则是一种铜介导的细胞死亡形式，与线粒体蛋白毒性应激、脂酰化蛋白聚集和铁硫簇蛋白丢失相关。这些通路与RA高度相关，因为RA与氧化应激密切相关，活性氧（ROS）升高、慢性滑膜炎症和金属离子稳态紊乱（包括铁过载和铜失衡）可能共同促进细胞损伤、免疫激活和关节破坏。然而，铁死亡和铜死亡相关基因在RA中的联合贡献，特别是与免疫失调的关系，仍未被充分理解。因此，本研究旨在通过整合生物信息学框架，系统探究金属依赖性调节性细胞死亡在RA发病机制中的作用，并识别候选生物标志物和治疗靶点。
二、主要技术方法
研究人员采用了多步骤整合生物信息学工作流程。首先从基因表达综合数据库（GEO）获取GSE294225数据集，包含15例健康对照和9例活动期RA患者（DAS28 > 2.7）的外周血CD14+单核细胞批量RNA测序数据，共24个样本，初始基因计数矩阵包含18,205个基因，经方差稳定变换（VST）标准化后保留15,397个基因。其次使用DESeq2进行差异表达分析，以校正后P < 0.05和|log2FC| > 1为阈值。随后采用WGCNA构建加权基因共表达网络，软阈值功率b = 9，识别与RA表型相关的关键模块。铁死亡相关基因从FerrDb V3数据库获取共1,519个非冗余基因，铜死亡相关基因从2022至2025年发表的文献中筛选共177个基因。功能富集分析使用clusterProfiler进行GO、KEGG和Reactome通路分析。免疫浸润分析采用18种免疫细胞标志基因签名进行ssGSEA评分。药物靶点分析使用DGIdb数据库。单细胞RNA测序分析使用GSE296117数据集（RA滑膜液）。外部验证使用GSE55235、GSE55457、GSE77298、GSE93272和GSE169082五个独立GEO数据集。
三、研究结果
3.1 差异表达基因的鉴定
DESeq2差异表达分析在RA与健康对照CD14+单核细胞样本间鉴定出1,410个显著差异表达基因（校正后P < 0.05，|log2FC| > 1），其中1,200个基因上调，210个基因下调。上调最显著的基因包括TNF（log2 FC = 6.61）、IL1B（log2 FC = 5.15）、PPIF（log2 FC = 2.63）、SPHK1（log2 FC = 2.80）和ARMC5（log2 FC = 1.94），这些基因涉及炎症信号、线粒体调控和鞘脂代谢等关键通路。
3.2 铁死亡和铜死亡相关候选基因的鉴定
在1,519个铁死亡相关基因中，113个基因在RA中显著差异表达且以上调为主。在177个铜死亡相关基因中，6个基因差异表达且大部分上调。上调DEGs与铁死亡和铜死亡基因列表的交集分析发现4个重叠基因：FTH1、SOD2、SCO2和CDKN2A。FTH1是控制细胞内铁浓度的主要铁储存蛋白，决定铁死亡易感性；SOD2是线粒体抗氧化酶，负责解毒超氧自由基；SCO2是线粒体铜结合蛋白，参与细胞色素c氧化酶组装；CDKN2A是调控细胞周期阻滞和细胞衰老的肿瘤抑制因子。
3.3 WGCNA揭示与RA相关的关键枢纽基因
WGCNA共鉴定出29个共表达模块，其中蓝色模块与RA表型呈最强显著正相关（Pearson相关系数r = 0.65，p < 0.001），包含2,778个基因。将蓝色模块基因与显著上调DEGs及铁死亡和铜死亡基因列表整合后，最初发现4个共有基因，但经模块成员度（MM > 0.82）和基因显著性（GS > 0.68）标准筛选后，仅FTH1、SOD2和CDKN2A符合最终枢纽基因标准，SCO2因未达到网络连接性标准而被排除。
3.4 候选枢纽基因的功能特征
GO功能富集分析显示，SOD2、CDKN2A和FTH1在细胞组分方面富集于自噬溶酶体、次级溶酶体、线粒体类核、异染色质和自噬体等亚细胞结构；在分子功能方面显著富集于三价铁和二价铁离子结合、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂活性、SUMO转移酶活性和氧化还原酶活性。Reactome通路分析鉴定出线粒体翻译、柠檬酸循环（TCA循环）和呼吸电子传递的显著富集。KEGG富集分析突出神经退行性疾病、氧化磷酸化和自噬通路。
3.5 跨队列外部验证
在GSE55235、GSE55457和GSE77298三个独立滑膜组织数据集中确认了FTH1和CDKN2A在RA中的上调表达。SOD2在GSE77298（GPL570平台）中验证上调，但未在GPL96平台的GSE55235和GSE55457中检测到。GSE169082（PBMC）分析进一步确认了全部三个基因的上调。多个独立队列和组织来源（PBMC和滑膜）的重复验证增强了结果的可靠性。
3.6 枢纽基因与免疫细胞浸润的关联
两样本t检验显示，FTH1在RA中的平均表达量（14.11）显著高于健康对照（13.05）（t = 7.39，p = 2.27 × 10-7）；SOD2在RA中的表达（平均14.74）也显著高于健康对照（平均13.26）（t = 3.33，p = 0.0098）；CDKN2A在RA（平均5.46）与健康对照（平均5.11）之间无显著差异（p = 0.0627）。Spearman相关分析显示，SOD2与CD8+T细胞呈正相关（r ≈ 0.3–0.5），CDKN2A与Th1和Th2细胞分化标志物相关，FTH1与巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞等髓系细胞亚群相关性最高。Shannon多样性指数在RA中略低于健康对照（p = 0.053），提示RA中免疫多样性有降低趋势。
3.7 枢纽基因表达的单细胞验证
GSE296117数据集（RA滑膜液）的单细胞分析显示，CDKN2A在巨噬细胞中表达最高（中位数约2–2.5），在T细胞和成纤维细胞中显著表达；SOD2在巨噬细胞（中位数5）和成纤维细胞中高表达；FTH1呈广泛细胞类型表达，在巨噬细胞（中位数6–7）和成纤维细胞（中位数5–6）中最高。这些结果表明枢纽基因主要在RA滑膜微环境的髓系（巨噬细胞富集）和基质（成纤维细胞）区室中表达。
3.8 候选治疗化合物的鉴定
药物-靶点相互作用分析发现多个已批准药物预测与枢纽基因相互作用。CDKN2A与多种抗癌药物相互作用，包括ribociclib（相互作用评分最高，0.52）、vemurafenib、cobimetinib、dabrafenib、trametinib等，以及免疫抑制性mTOR抑制剂everolimus和sirolimus。SOD2与甲氨蝶呤（RA治疗的金标准DMARD）相互作用，还涉及valproic acid、paclitaxel、docetaxel、doxorubicin、daunorubicin和asparaginase（相互作用评分最高，0.73）。FTH1主要与Ferritarg P（一种尚未获批临床的铁蛋白靶向药物）相互作用，相互作用评分极高（52.2）。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究的整合分析构建了一个金属离子代谢和氧化应激失调促进促炎性单核细胞状态形成并与适应性免疫亚群协调的网络。FTH1调控细胞内铁缓冲，在铁过载情况下可能使细胞易发生铁死亡；SOD2对抗线粒体ROS，根据细胞环境可抑制或增强铁死亡/铜死亡信号；CDKN2A促进细胞衰老，可能增加细胞对金属诱导蛋白毒性应激的易感性。药物-基因相互作用分析揭示了具有临床意义的化合物：甲氨蝶呤与SOD2的相互作用提示其传统免疫抑制活性与氧化性细胞死亡通路调控之间存在机制重叠；mTOR抑制剂（everolimus、sirolimus）对CDKN2A信号的抑制提示免疫检查点控制可与细胞周期/衰老调控协同作用；Ferritarg P作为铁蛋白靶向化合物，是铁死亡调控在RA中具有生物学前景的研究方向。
研究局限性包括：分析基于外周血单核细胞而非滑膜组织，可能无法完全反映关节微环境；样本量有限（n = 24）；免疫浸润评分来自批量RNA共表达基因，需流式细胞术或单细胞RNA测序等正交方法验证；铁死亡和铜死亡基因列表可能遗漏新发现的调控因子；研究主要聚焦于上调基因，下调基因的潜在保护性作用有待进一步研究；当前研究基于转录组和网络水平关联，不直接涉及铁死亡和铜死亡之间功能相互作用的机制验证。
研究结论：本研究采用整合转录组学方法分析RA患者外周血单核细胞，发现了一个富含金属依赖性调节性细胞死亡通路的相关共表达模块。该模块与精选铁死亡和铜死亡基因集的交集鉴定出三个主要枢纽基因FTH1、SOD2和CDKN2A，这些基因在RA中高度上调并在基因网络中处于核心位置。功能富集分析确认了它们在铁代谢、氧化应激反应、自噬和细胞周期调控中的作用，表明金属稳态适应不良和氧化损伤参与RA病理生理过程。免疫细胞浸润分析提示这些枢纽基因与淋巴系和髓系免疫细胞亚群密切相关。独立队列的外部验证进一步增强了这些候选基因在RA发病中潜在相关性和稳健性。这些发现为理解铁死亡、铜死亡与RA免疫失调之间的关联提供了新的机制概念，并提示这些靶基因可作为潜在的生物标志物和治疗选择。
