《Nucleic Acids Research》：Programmable in vivo mRNA circularization for enhanced gene expression in bacteria
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摘要：mRNA的分钟级寿命强烈影响细菌基因表达，而一种稳健且可编程的直接控制mRNA稳定性和拓扑结构的方法仍然难以实现。在此，研究人员开发了CRESEnT（Circular RNA Expression for Stable and Enhanced Tran
摘要：mRNA的分钟级寿命强烈影响细菌基因表达，而一种稳健且可编程的直接控制mRNA稳定性和拓扑结构的方法仍然难以实现。在此，研究人员开发了CRESEnT（Circular RNA Expression for Stable and Enhanced Translation，即用于稳定和增强翻译的环状RNA表达系统），这是一种基于排列内含子-外显子架构的可编程体内mRNA环化系统，用于工程化改造mRNA拓扑结构。CRESEnT能够便捷地实现mRNA环化，从而在多种启动子、核糖体结合位点（RBS）变体、遗传负载和细菌宿主中显著增加蛋白质表达。此外，将CRESEnT应用于生物合成途径可提高多种高附加值代谢产物的产量，表明mRNA环化可用于改善微生物细胞工厂的代谢性能。总之，这些结果确立了通过环化进行RNA拓扑工程改造作为控制细菌基因表达和增强微生物细胞功能的一个变革性方向。
论文解读：基于CRESEnT的细菌体内mRNA环化及其在增强基因表达和代谢工程中的应用
**研究背景与问题**
细菌基因表达受mRNA寿命的严格调控，线性mRNA在细胞内通常仅具有分钟级的半衰期，这极大限制了重组蛋白和代谢产物的高效生产。尽管已有研究通过改造启动子、核糖体结合位点（RBS）和密码子分布等策略来优化基因表达，但mRNA本身的快速降解仍是制约细菌表达系统性能的关键瓶颈。与真核mRNA具有5′帽、poly-A尾和RNA结合蛋白等保护机制不同，细菌mRNA普遍缺乏这些保护性元件，极易被内源RNase降解。虽然快速周转有利于细菌适应环境变化，但在相对恒定的生物反应器条件下，这种不稳定性对微生物细胞工厂的生产效率是不利的。RNA环化能通过拓扑结构转变使转录本获得对RNase的抗性，特别是抵抗外切酶介导的降解，因而成为解决上述问题的潜在策略。然而，已有的基于排列内含子-外显子（PIE）系统的RNA环化研究多集中于非编码RNA或重复蛋白的表达，在细菌中通过mRNA环化普遍增强功能性蛋白表达仍面临诸多挑战。此外，细菌中转录和翻译偶联，核糖体加载与RNA环化同时发生，这使得在细菌中实现基于mRNA环化的高效蛋白表达需要更精细的表达盒设计。
**研究目的与主要工作**
针对上述问题，研究人员开发了CRESEnT系统，这是一种基于T4噬菌体Td内含子的可编程体内mRNA环化平台。该系统通过将Td内含子分裂为两半并分别置于目标基因两侧，利用I型内含子的自剪接活性将mRNA的5′和3′末端共价连接，形成环状RNA。研究人员系统优化了表达盒的架构，包括5′-非翻译区（UTR）和3′-UTR的长度以及引入互补杂交臂以促进内含子间相互作用，从而显著提高了环化效率和蛋白质表达。随后，研究人员验证了CRESEnT在不同启动子、RBS变体、多种遗传负载以及多种细菌宿主中的通用性，并将其应用于代谢工程，成功提高了多种高附加值代谢产物的产量。
**关键技术与方法**
研究人员构建了基于PIE架构的CRESEnT表达盒，并以缺失外显子核心序列（ECS）的版本作为线性对照（LIN）。研究中使用了T4噬菌体Td内含子作为剪接模块，通过PCR和Gibson assembly构建质粒。为定量环化效率，研究人员设计了收敛和发散引物对，结合微滴数字PCR（ddPCR）分别检测总RNA和环状RNA。mRNA稳定性通过利福平抑制转录后的衰减实验测定。蛋白质表达通过荧光报告基因检测和western blot分析。代谢产物产量通过紫外-可见分光光度法或高效液相色谱（HPLC）定量。研究中使用的细菌宿主包括大肠杆菌（Escherichia coli）K-12 MG1655、BL21 (DE3)、W、Nissle 1917，以及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB700和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032。
**研究结果**
**1. CRESEnT可在细菌体内产生环状mRNA**
研究人员采用PIE系统构建CRESEnT，将T4噬菌体Td内含子在P6臂处分裂，并将两半分别置于目标基因（mCherry）两侧，同时保留T4噬菌体外显子核心序列（ECS）以促进剪接。缺失ECS的版本作为线性对照（LIN）。在E. coli K-12 MG1655中表达mCherry后，CRESEnT的荧光信号较LIN提高2.68倍。通过设计收敛和发散引物并结合ddPCR，研究人员检测到CRESEnT构建体中存在环状RNA，而LIN中未检测到环状RNA信号。CRESEnT的环化效率为26.4%。
**2. 优化UTR长度和杂交臂长度可提高环化效率**
研究人员系统优化了5′-UTR和3′-UTR的长度。当5′-UTR长度为35 bp时，mCherry表达较LIN提高3.26倍，环化效率最高；当3′-UTR长度为24 bp时，蛋白表达和环化效率均达到最大值。蛋白表达水平与RNA环化效率呈正相关。此外，研究人员在分裂内含子之间引入互补杂交臂以增强内含子间配对。随着杂交臂长度增加，荧光强度和环化效率逐步提高，但超过35 bp后反而下降，可能是由于过长双链RNA（dsRNA）区域易被内源RNase III降解。最终选用30 bp杂交臂，使mCherry表达较LIN提高5.95倍。
**3. mRNA环化提高RNA丰度、稳定性和翻译效率**
通过ddPCR定量，优化后的CRESEnT使RNA丰度较LIN提高3.95倍，而初始构建体仅提高2.25倍。对线性对照施加相同的UTR和杂交臂修饰仅使RNA丰度提高1.20倍，说明RNA丰度增加与环化相关。在利福平处理后的10分钟追踪中，LIN转录本持续下降，而CRESEnT转录本基本保持不变，表明环状RNA具有显著增强的稳定性。此外，将荧光强度归一化至转录本丰度后，CRESEnT的每转录本蛋白输出较LIN提高1.51倍，说明环化也适度提高了翻译效率。
**4. CRESEnT在不同基因表达背景下均能增强蛋白表达**
研究人员在E. coli中测试了多种J23系列启动子（依赖天然RNA聚合酶）和T7启动子变体（依赖T7 RNA聚合酶）。在所有测试启动子下，CRESEnT均较LIN提高mCherry表达，表明其效应与转录机制无关。进一步将CRESEnT与不同强度的RBS变体组合，在全部RBS下均观察到蛋白表达提升，尽管最弱RBS04的增强倍数较小，可能因为低核糖体负载使mRNA更易受RNase E降解。总体而言，CRESEnT在不同转录和翻译背景下均能一致增强蛋白表达。
**5. CRESEnT适用于多种遗传负载和细菌宿主**
将mCherry报告基因替换为mTagBFP和sGFP后，CRESEnT仍能增强荧光表达。将mCherry融合至E. coli内源基因（总长度1371～3543 bp），CRESEnT较LIN提高表达1.60～7.29倍。其中长度最大（3543 bp）的ileS-mCherry增强倍数最小，提示长片段可能增加RNA末端间物理距离，降低内含子间有效相互作用概率。在E. coli BL21 (DE3)、W和Nissle 1917等多种菌株中，CRESEnT均较LIN提高表达，其中BL21 (DE3)增强12.24倍，可能与蛋白酶缺陷背景有关。在革兰氏阳性菌B. subtilis WB700和工业相关宿主C. glutamicum中，CRESEnT分别提高表达3.37倍和1.73倍，证明其跨宿主通用性。
**6. CRESEnT可提高代谢途径性能**
研究人员将CRESEnT应用于4种代谢产物的生物合成。黄素（flaviolin）由III型聚酮合酶RppA合成，CRESEnT表达rppA使黄素产量较LIN提高2.74倍，western blot确认RppA丰度增加。衣康酸由顺式乌头酸脱羧酶CadA催化，CRESEnT使衣康酸滴度提高约1.52倍，CadA丰度增加。番茄红素需要CrtE、CrtB和CrtI协调表达，将crtE置于CRESEnT控制下，番茄红素产量提高1.60倍，CrtE丰度增加。紫色杆菌素途径中，将vioD置于CRESEnT控制下，紫色杆菌素滴度提高1.62倍，尽管western blot未显示VioD丰度显著增加，可能因其固有蛋白不稳定性，但产量数据仍表明CRESEnT能改善途径性能。
**讨论与结论**
研究人员指出，细菌中高效mRNA环化需要平衡内含子剪接所需的RNA结构、核糖体加载的可及性以及避免过度暴露于内切核糖核酸酶等三方面因素。5′-UTR和3′-UTR最适长度不同，可能与核糖体在两种UTR上的物理占位差异有关。环化通过去除游离RNA末端提高了转录本对核酸外切酶的抗性，同时5′和3′端共价连接可能通过缩短终止密码子与翻译起始区之间的有效距离促进核糖体循环利用，从而提高翻译效率。CRESEnT与现有基因表达控制策略正交兼容，可作为一种额外调控层。折叠增强倍数在不同宿主中有所差异，可能与宿主内切核糖核酸酶活性和Td内含子剪接效率有关。未来可通过工程化分裂内含子或开发替代自剪接内含子进一步提升系统性能。
研究结论：研究人员开发了CRESEnT作为细菌中通过体内mRNA环化进行RNA拓扑工程的可编程平台。通过系统优化UTR间距和杂交臂长度，显著提高了RNA环化效率和蛋白质产量。优化的CRESEnT系统在多种遗传背景、货物类型和细菌宿主中均能稳健工作，展示了其与现有合成生物学工具包的广泛兼容性。研究人员还通过增强途径酶表达提高了多种高附加值代谢产物的产量，证明了其在代谢工程中的实用性。总体而言，CRESEnT为通过RNA拓扑工程扩展细菌基因控制提供了广泛适用的框架。
