利用离子迁移谱与红外离子光谱鉴定氟喹诺酮类抗生素在质谱分析中的质子化异构体

《International Journal of Mass Spectrometry》：Identification of fluoroquinolone protonation isomers in mass spectrometry using ion mobility spectrometry and infrared ion spectroscopy

　　

氟喹诺酮类抗生素在气相中表现出多样的质子化行为。在（生物）质谱（mass spectrometry, MS）分析中，电喷雾电离（electrospray ionization, ESI）是最广泛应用的离子化技术之一。在正离子模式下，ESI通常产生质子化物种[M+H]+。对于具有多个碱性位点的化合物，不同的质子化异构体（protomers）可能在离子群体中竞争或共存。此外，溶液中热力学最稳定的质子化异构体未必对应于气相中最稳定的结构，这进一步引发了关于质谱仪中实际存在质子化异构体的问题。质子的位置可显著影响离子的气相结构与反应活性，例如，不同质子化异构体可能导致不同的串联质谱（MS/MS）谱图以及离子迁移谱（ion mobility spectrometry, IMS）实验中测得的碰撞截面积（collision cross section, CCS）值。因此，多种质子化异构体的存在可能使谱图解析和结构归属复杂化，因为质子化异构体群体的变化可能导致与库中MS/MS谱图不匹配。研究人员利用离子迁移谱结合红外离子光谱（infrared ion spectroscopy, IRIS）对四种氟喹诺酮类化合物（帕珠沙星、吉米沙星、莫西沙星和达诺沙星）进行了系统研究。通过将迁移率选择的离子群体与量子化学计算的红外光谱进行比较，实现了对质子化位点的归属。结果表明，质子化行为具有强烈的化合物依赖性：帕珠沙星和吉米沙星在气相中均以O-质子化（O-I）形式存在；莫西沙星则同时存在O-质子化（O-I）和N-质子化物种，且其N-II质子化异构体在迁移率分离后发生了向N-I的质子迁移重排；达诺沙星则表现出三种迁移率特征，分别归属于O-I质子化异构体和N-I质子化异构体的两种立体异构形式。该研究揭示了离子迁移分离后的下游传输或储存过程中可能发生质子迁移，从而改变质子化异构体分布，强调了将IMS与IRIS联用作为解决质谱结构分析中质子化异构体复杂性的有效策略。

论文解读：氟喹诺酮类抗生素质子化异构体的质谱鉴定研究

一、研究背景与意义

在生物质谱分析中，电喷雾电离（electrospray ionization, ESI）是最为广泛应用的离子化技术。在正离子模式下，ESI通常产生质子化物种[M+H]⁺。对于含有多个碱性位点的化合物而言，不同的质子化异构体（protomers）可能在离子群体中竞争或共存。更为复杂的是，溶液中热力学最稳定的质子化异构体未必对应于气相中最稳定的结构，这引发了关于质谱仪中实际存在的质子化异构体究竟为何种结构的疑问。质子的位置可显著影响离子的气相结构与反应活性，不同质子化异构体可能导致不同的串联质谱（MS/MS）谱图和不同的碰撞截面积（collision cross section, CCS）值，从而使谱图解析和结构归属变得复杂，甚至导致与库中MS/MS谱图的失配。

氟喹诺酮类抗生素作为人医和兽医领域治疗多种细菌感染的高效抗生素，共享4-喹诺酮环结构并在6位含有氟原子。围绕这一核心结构，不同氟喹诺酮类化合物的官能团各异。氟喹诺酮类化合物含有多个杂原子作为可能的质子化位点，包括羰基氧和胺类（叔胺、仲胺和伯胺），这给ESI-MS的详细分析带来了挑战。此前的IMS-MS研究已报道氟喹诺酮类化合物可形成多种质子化异构体，且表现出不同的碎裂途径。更重要的是，这些质子化异构体的相对丰度依赖于多种实验条件，如锥孔电压或溶剂种类，说明氟喹诺酮类化合物的质子化行为对电离条件的细微变化高度敏感。

尽管离子迁移谱（ion mobility spectrometry, IMS）能够分离质子化异构体，但仅基于计算CCS值将特定质子化位点归属到某一迁移率分离峰并不总是直接可行。此外，离子迁移分离和后续选择并不能保证特定质子化异构体结构在下游离子传输、储存或碰撞活化过程中得以保持。因此，单独的MS/MS实验可能无法明确区分原始的迁移率选择结构与在活化前或活化过程中形成的重排物种，尤其是在产生相似碎裂模式的情况下。为突破这些限制，需要将更直接的结构探针与离子迁移选择相结合。红外离子光谱（infrared ion spectroscopy, IRIS）能够提供质量和迁移率选择离子的振动光谱，给出对质子化位点高度敏感的指纹特征。通过将实验红外光谱与量子化学计算比较，可以超越单独使用MS/MS分析所能达到的质子化位点归属能力。

本研究针对四种氟喹诺酮类化合物（帕珠沙星、吉米沙星、莫西沙星和达诺沙星），将离子迁移分离与IRIS相结合，系统研究其质子化行为，通过迁移率选择的离子群体光谱表征并与计算红外光谱比较，归属其质子化位点，进而推断这些结构在下游质谱分析过程中是否得以保持。该研究发表在《International Journal of Mass Spectrometry》。

二、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：基于傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FT-ICR MS，配备7-T超导磁体和俘获离子迁移谱TIMS分析器）的正离子ESI分析；TIMS迁移率分离与门控TIMS模式实现离子迁移选择；红外多光子解离（IRMPD）光谱实验，利用FELIX自由电子激光器在800–1900 cm^?1和2500–3700 cm^?1两个红外频率范围获取振动光谱；碰撞诱导解离（CID）和持续离共振辐照碰撞诱导解离（SORI-CID）用于碎裂行为表征；密度泛函理论（DFT）计算生成理论振动光谱，采用CREST进行构象空间搜索，ωB97x-D/6-311++G**和ωB97x-D/aug-cc-pVTZ水平优化，MP2单点能量计算精化相对能量；MobCal-MPI 2.0.3计算N₂ CCS值；势能面扫描和过渡态计算研究质子迁移诱导的异构化。样品为购自Sigma-Aldrich的达诺沙星、帕珠沙星、盐酸莫西沙星和甲磺酸吉米沙星，以微摩尔浓度溶于LC-MS级甲醇中制备。

三、研究结果

3.1 单质子化异构体体系：帕珠沙星和吉米沙星

帕珠沙星和吉米沙星在TIMS迁移谱中均表现出单一主导峰，伴有稍高CCS值的次要贡献。实验CCS值与各自O-I质子化异构体的计算值高度吻合，O-I质子化发生在羰基氧上，是所有物种中能量最低的质子化异构体。SORI-CID碎裂显示两种化合物均发生H₂O丢失，支持O-质子化物种的归属。实验IRIS光谱与O-I质子化异构体的DFT计算红外光谱良好吻合，进一步确认了O-I归属。值得注意的是，DFT计算预测在约3100 cm^?1处存在强烈的OH⁺伸缩振动带，而实验观察到的则是严重展宽的宽峰（3100–3300 cm^?1），这种极端展宽是质子共享于两个紧密相邻氧原子之间的特征，静态谐振子处理无法充分描述。对于吉米沙星，N-IV质子化异构体的CCS值与实验值接近，表明仅凭CCS无法排除该结构，但其计算红外光谱与实验数据不匹配，结合观察到的H₂O丢失，排除了N-IV质子化异构体。

3.2 莫西沙星的质子化异构体结构

莫西沙星在TIMS迁移谱中表现出两个明显特征峰，分别为191.8 ?²（峰A）和198.3 ?²（峰B）。峰A与O-质子化物种（O-I，191 ?²）的计算CCS值吻合，SORI-CID碎裂显示特征性H₂O中性丢失，支持O-质子化归属。峰B的SORI-CID碎裂显示CO₂丢失，表明其为N-质子化物种。峰B与叔胺质子化（N-II，两种立体异构体分别为197和200 ?²）的计算CCS值最吻合，而仲胺质子化（N-I，206 ?²）的CCS值显著更大。然而，TIMS选择的峰B IRIS光谱无法被单独的N-II计算光谱完全重现，N-I质子化异构体的计算光谱对于解释实验光谱中约3300 cm^?1处的特征（NH₂⁺伸缩振动）是必要的，而N-II质子化异构体对于解释约3200 cm^?1处的红外强度（NH⁺伸缩振动）是必要的。研究人员提出，质子迁移发生在TIMS阶段之后、ICR池中红外探测之前，即在离子传输和/或储存部分发生了N-II向N-I的异构化。N-I和N-II(S)质子化异构体三维结构中两个质子化位点之间的距离较小（约2.2 ?），表明质子迁移易于发生。N-I向N-II(S)重排的过渡态能量约为30 kJ/mol，可能因碰撞池中残留水分子的瞬态配位而降低。因此，两种质子化形式可能共同贡献于峰B的IRIS光谱，这与TIMS选择后的异构化一致。

3.3 三种质子化异构体：达诺沙星

达诺沙星表现出一个主迁移率峰（181.2 ?²，峰A）和两个较小特征峰（192.8和196.2 ?²，峰B和C）。峰A与O-I质子化异构体的计算CCS值（181 ?²）良好吻合，SORI-CID碎裂显示H₂O丢失，支持O-质子化归属。峰B和C的实验CCS值与N-I质子化异构体的两种立体异构体（194和195 ?²）最佳吻合，SORI-CID碎裂均显示CO₂丢失，支持其为两种N-质子化物种。TIMS-IRIS实验表明，峰A的光谱与O-I计算光谱良好吻合，结构归属明确。峰B和C的实验IR光谱与N-I(R)、N-I(S)的计算光谱在指纹区表现出更好的吻合，特别是在约1600 cm^?1区域。在高波数区域，N-I计算光谱重现了实验观察结果，实验光谱中强而尖锐的谱带归因于NH⁺伸缩振动模式，N-I(S)和N-I(R)的计算光谱分别准确重现了约3290和约3265 cm^?1的实验峰位，据此将峰B归属为N-I(R)，峰C归属为N-I(S)。两种N-II质子化非对映异构体的计算NH伸缩振动带与OH伸缩振动带重叠，且两种非对映异构体出现在相同频率，无法重现实验观察到的峰B和C之间的波数位移。与莫西沙星不同，达诺沙星未观察到N-II参与或质子重排的证据，这归因于达诺沙星的桥联双环结构限制了构象灵活性，阻止了氮原子充分接近以实现重排。

四、讨论与结论

该研究揭示了离子阱条件对O-质子化物种CID碎裂行为的影响。研究人员证明，碰撞池中延长的累积时间促进[M+H–H₂O]⁺ CID碎片重新结合水分子，有效再生成前体m/z处的离子，这可能对应于重新结合的复合物而非原始前体离子结构。其他碎片离子也表现出类似的质荷比位移，使CID谱图解析复杂化。这种效应在高真空SORI-CID条件下被抑制，强调了低真空条件下延长离子捕获对分析质谱工作流程中CID碎裂模式的影响。

对于所研究的四种氟喹诺酮类化合物，此前Ucur等人的MALDI-TIMS研究（未使用IRIS）得出的质子化异构体归属与本研究的测定结果一致。然而，研究人员发现其中一种物种在迁移率分离后发生了质子重排，可能发生在下游离子传输或储存过程中，在IRIS探测之前。这一发现之所以被识别，是因为重排未进行到完全互变，而是产生了IRIS检测到的混合离子群体。这些发现表明，IMS选择的质子化位点和构象结构在IMS后的离子传输和储存过程中可能因温和活化而发生质子转移，从而改变IMS分离后的质子化异构体分布。研究人员指出，所用IMS-MS仪器是良好的迁移率分析器，但不一定是良好的迁移率选择器。IMS与IRIS的联合使用为解决基于质谱的结构分析中质子化异构体相关的复杂性提供了有力策略。

研究结论可总结为：通过结合MS/MS、TIMS、IRIS和量子化学计算，研究人员研究了四种氟喹诺酮类化合物的气相质子化异构体分布。帕珠沙星和吉米沙星在气相中均以O-I质子化异构体形式存在，该归属由SORI-CID、TIMS和IRIS数据的一致性支持。莫西沙星表现出两个明显迁移率特征，分别对应O-质子化（O-I）和N-质子化物种，其中较大CCS特征基于SORI-CID和TIMS归属为N-II，但IRIS光谱需要N-I和N-II的共同贡献才能解释，表明TIMS选择后发生了N-II向N-I的质子转移。达诺沙星表现出三个迁移率特征，分别归属为O-I质子化异构体和N-I质子化异构体的两种立体异构形式，未观察到质子重排，这归因于其刚性双环结构限制了构象灵活性。