SmRAP2-4-SmAMR1-SmEF1A模块调控旱柳盐胁迫耐受性的分子机制

《Industrial Crops and Products》：The SmRAP2-4- SmAMR1- SmEF1A module regulates plant salt tolerance in Salix matsudana

　　

泛素化（ubiquitination）是一种由一系列酶促反应介导的重要植物翻译后调控系统。它特异性降解细胞内蛋白质，调节靶蛋白丰度，并在植物生长发育中发挥重要作用。F-box蛋白是Skp1-Cullin1-F-box蛋白（SCF）型泛素化复合体的核心因子，对于植物在各种环境条件下的表现至关重要。在本研究中，为了理解旱柳（Salix matsudana）中一个与拟南芥（Arabidopsis）中AtAMR1同源的F-box基因——SmAMR1——在耐盐性中的作用及其机制，研究人员探索了其在盐处理期间的表达模式，并通过基因转化评估了其对植物抗性的贡献。进一步地，利用酵母单杂交（Y1H）和酵母双杂交（Y2H） assays，确定了SmAMR1的上游转录因子和下游靶蛋白。研究发现，SmAMR1负调控旱柳的盐胁迫耐受性。SmAMR1与SmEF1A相互作用，并通过泛素化途径促进其降解。同时，转录因子SmRAP2-4在盐胁迫下抑制SmAMR1的表达水平。研究人员的发现建立了一个新的泛素化模块，用以阐明旱柳的耐盐机制。

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1. 研究背景与研究目的

植物在生长过程中常遭受盐胁迫等非生物逆境，严重影响其生长发育和地理分布。泛素化（ubiquitination）是真核生物中一种重要的翻译后修饰，通过特异性地降解目标蛋白，精细调控细胞内蛋白质的丰度和功能。其中，由Skp1-Cullin1-F-box蛋白组成的SCF复合体是一类关键的E3泛素连接酶。F-box蛋白作为该复合体的核心组分，负责识别并结合特定的底物蛋白，从而介导其泛素化和随后的降解。已有研究表明，多种F-box蛋白参与调控植物对干旱、高温、低温等多种逆境的响应，但其在木本植物耐盐性中的具体作用机制尚不明确。

旱柳（Salix matsudana Koidz.）作为一种重要的生态树种，具有较强的非生物胁迫抗性，尤其是耐盐性。研究人员前期转录组分析发现，在一个耐盐旱柳种质‘9901’中，一个与拟南芥AtAMR1同源的F-box基因SmAMR1在盐胁迫下表达受到抑制。基于此，本研究旨在深入探究SmAMR1在旱柳耐盐性中的具体功能、调控机制及其上下游互作网络，以期揭示一个新的耐盐调控模块，为林木抗逆分子育种提供理论依据和基因资源。

2. 主要研究方法

为实现上述研究目标，研究人员综合运用了多种分子生物学和生物化学技术：

1. 1.
   基因表达分析：采用实时荧光定量PCR检测SmAMR1及相关基因在盐处理不同时间点、不同组织中的表达动态。
2. 2.
   亚细胞定位：通过构建SmAMR1-GFP融合蛋白，在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中进行瞬时表达，利用激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。
3. 3.
   遗传转化与表型鉴定：分别将SmAMR1和SmEF1A基因转化至烟草（Nicotiana tabacum L. cv KY14）和旱柳愈伤组织中，获得过表达株系。通过种子萌发率、根长、存活率、生理指标（丙二醛含量、相对电导率、叶绿素含量）测定及组织化学染色（DAB、NBT、台盼蓝染色），系统评估转基因材料在盐胁迫下的耐受性变化。
4. 4.
   蛋白互作研究：利用酵母双杂交（Y2H）、荧光素酶互补成像（LCA）和双分子荧光互补（BiFC） assay，验证SmAMR1与候选靶蛋白SmEF1A之间的物理相互作用。
5. 5.
   泛素化降解分析：通过Western blot实验，在添加或不添加蛋白酶体抑制剂MG132的情况下，检测SmAMR1过表达烟草中SmEF1A的蛋白积累水平，以证实SmAMR1介导SmEF1A的降解。
6. 6.
   转录调控研究：采用酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告基因（Dual-LUC） assay，鉴定并验证上游转录因子SmRAP2-4与SmAMR1启动子的结合及其对SmAMR1表达的调控作用。
7. 7.
   分子对接模拟：利用AlphaFold3数据库和PyMOL软件，构建SmAMR1与SmEF1A以及SCF^SmAMR1复合体的三维结构模型，预测其相互作用的关键氨基酸位点。

3. 研究结果

3.1 SmAMR1的表达模式与亚细胞定位

在正常条件下，SmAMR1在各组织中均有表达，茎中最高。然而，在300 mM NaCl处理后，其在根、茎、叶中的表达水平均随时间推移显著下降，表明其参与了旱柳的盐胁迫应答。亚细胞定位结果显示，SmAMR1蛋白定位于细胞核和细胞质中，提示其可能在多个细胞区室中发挥作用。

3.2 SmAMR1过表达降低了植物的耐盐性

将SmAMR1在烟草中过表达后，转基因株系在含100 mM NaCl的培养基上种子萌发率和幼苗根长均显著低于野生型（WT）。在盆栽实验中，盐处理后转基因烟草的存活率（约30%-36%）远低于WT（61%），且积累了更多的活性氧（O₂^-、H₂O₂），表现出更高的膜脂过氧化程度（MDA含量升高）、电解质渗漏率（REL升高）和更低的叶绿素含量。同样，在旱柳愈伤组织中过表达SmAMR1也导致其在盐胁迫下的增殖率显著降低，并加剧了细胞损伤。这些结果表明SmAMR1是一个盐胁迫响应的负调控因子。

3.3 SmAMR1与SmEF1A的相互作用

通过Y2H筛选旱柳cDNA文库，鉴定到SmEF1A（延伸因子1α）为SmAMR1的候选互作蛋白。进一步的Y2H、LCA和BiFC assay均证实了二者在体内外的物理相互作用。亚细胞定位显示SmEF1A同样分布于细胞核和细胞质，与SmAMR1的定位一致。分子对接模型预测了二者通过多个氢键形成稳定复合物的潜在氨基酸位点。

3.4 SCF^SmAMR1复合体介导SmEF1A的降解

Y2H实验证明SmAMR1能够与SCF复合体的另一组分SmSKP1相互作用，而非SmCUL1。分子对接模型展示了SmAMR1、SmSKP1和SmCUL1如何组装成SCF^SmAMR1复合体，并进一步与靶蛋白SmEF1A结合。Western blot结果显示，在SmAMR1过表达的烟草叶片中瞬时表达SmEF1A，其蛋白积累量显著低于WT叶片。而加入蛋白酶体抑制剂MG132后，SmEF1A的蛋白水平得以恢复。这有力地证明了SmAMR1通过SCF^SmAMR1复合体，依赖泛素-26S蛋白酶体途径特异性降解SmEF1A蛋白。

3.5 SmEF1A增强植物耐盐性

与SmAMR1相反，SmEF1A在旱柳根部的表达受盐胁迫诱导上调。在旱柳愈伤组织中过表达SmEF1A，可显著提高其在盐胁迫下的增殖率，并减少ROS积累和细胞死亡。在烟草中过表达SmEF1A同样增强了植株的耐盐性，表现为盐处理后MDA含量和REL值更低，叶绿素含量更高，存活率（约59%-69%）显著高于WT（33%）。

3.6 SmRAP2-4负调控SmAMR1的表达**

通过Y1H筛选，鉴定到一个AP2/ERF家族转录因子SmRAP2-4能够结合到SmAMR1的启动子上。Dual-LUC assay进一步证实SmRAP2-4可以抑制SmAMR1启动子的活性。表达分析显示，在盐胁迫下，SmRAP2-4的表达被诱导上调，而SmAMR1的表达则被抑制，二者呈现负相关关系。通过对启动子片段的分段分析，Y1H实验精确定位了SmRAP2-4的结合位点为SmAMR1启动子上的GCC box-like 1元件。

4. 讨论与结论

讨论总结

本研究的发现进一步丰富了F-box蛋白在植物逆境响应中的复杂角色。尽管多数F-box蛋白如AtDIF1、AtSDR和ShPP2-1被报道为抗逆性的负调控因子，但也有如AtPP2-B11和MdMAX2等正调控因子的存在。SmAMR1作为负调控因子，其机制在于通过SCF^SmAMR1复合体靶向降解正调控因子SmEF1A，从而削弱植物的耐盐性。这种通过降解蛋白合成关键因子来影响整体抗逆性的策略，是一种新颖的调控方式，有别于以往发现的针对特定转录因子或代谢酶的降解。同时，上游转录因子SmRAP2-4对SmAMR1的抑制，构成了一个完整的信号调控级联。SmEF1A作为蛋白翻译延伸因子，其维持稳定对于逆境下大量胁迫诱导蛋白的合成至关重要，因此过表达SmEF1A能有效提升植物耐盐性，这与前人在蒺藜苜蓿和拟南芥中的研究结果一致。

研究结论翻译

基于研究人员的发现，盐胁迫可以诱导转录因子SmRAP2-4的表达，后者结合到SmAMR1的启动子上并抑制其表达。SmAMR1作为一个典型的F-box蛋白，能与SmSKP1相互作用，后者再与SmCUL1相连。由此产生的E3泛素连接酶复合体SCF^SmAMR1能够靶向并降解底物蛋白SmEF1A，而SmEF1A是蛋白质翻译过程中的一个必需组分。过表达SmEF1A可以增强植物对盐胁迫的耐受性。综上所述，SmRAP2-4-SmAMR1-SmEF1A模块为旱柳的抗逆过程提供了一条新的通路。SmRAP2-4和SmEF1A可以作为非生物胁迫分子育种计划中的基因资源。