氧化应激诱导溶酶体钙释放引起的线粒体凋亡：对屠宰后成熟期间羊肉品质的影响

《Food Bioscience》：Mitochondrial apoptosis due to oxidative stress-induced lysosomal calcium release: Effects on lamb meat quality during postmortem aging

　　

**摘要** 溶酶体作为细胞内主要的钙库，其溶酶体阳离子通道瞬时受体电位黏蛋白脂蛋白1（TRPML1）在氧化应激下充当活性氧（ROS）敏感的Ca2?释放途径。然而，溶酶体Ca2?释放介导的线粒体凋亡在调控死后羔羊肉质过程中的作用尚未阐明。本研究中，将特异性TRPML1抑制剂黏蛋白特异性合成抑制剂3（ML-SI3）或生理盐水（对照组）注入羔羊背最长肌，并在死后0、6、12、24、72和120小时测定相关指标。结果显示，ROS水平升高改变了溶酶体膜通透性（LMP），上调TRPML1表达。溶酶体通透化后，Ca2?通过膜接触位点转移至线粒体，显著增加线粒体Ca2?含量（P < 0.05），从而触发凋亡。这表现为线粒体通透性转换孔（MPTP）开放增加、细胞色素c（Cyt-c）释放增加，以及caspase-9和caspase-3上调（P < 0.05）。因此，在死后熟成过程中，肌原纤维破碎指数（MFI）升高，剪切力下降（P < 0.05），表明肉质嫩度改善。然而，烹饪损失也增加（P < 0.05），提示持水力（WHC）下降。与对照组相比，ML-SI3处理抑制了TRPML1表达，减少了溶酶体Ca2?释放，缓解了线粒体钙超载，降低了Cyt-c释放，从而显著抑制了caspase-3/9活性和凋亡（P < 0.05）。同时，烹饪损失显著降低（P < 0.05），表明ML-SI3延缓了嫩化并改善了WHC。

**引言** 滩羊肉以其细嫩的质地、均匀分布的脂肪含量和清淡的膻味而受到消费者的高度青睐（B. Wang等，2021）。嫩度、持水力和色泽是评价肉质的重要标准。凋亡是调控肉质的重要生化途径，主要受涉及线粒体、死亡受体和内质网应激的信号通路调控（Zhao等，2025）。近年来，凋亡在调控肉质嫩度方面的作用已被广泛研究。现有证据表明，凋亡促进骨骼蛋白的水解，导致肌原纤维弱化、破碎指数升高和剪切力下降，从而改善肉质嫩度（Joo等，2023；Zhang等，2013；Zhao等，2025）。此外，大量研究表明，凋亡通过降解细胞骨架和破坏膜结构，增加水分流失通道，从而对肉制品的WHC产生负面影响（Ijaz等，2020；Soglia等，2016；Vaskoska等，2020）。而且，在氧化应激条件下，溶酶体Ca2?释放介导的线粒体凋亡引起线粒体损伤和酶活性降低或失活，破坏电子传递链，最终导致高铁肌红蛋白（MetMb）积累和肉类褐变（Lanari & Cassens, 1991；Mitacek等，2019；Tang等，2005）。

细胞内Ca2?是细胞代谢与功能之间的重要桥梁（Khairullah等，2026）。肌浆网作为Ca2?的主要储存库，负责肌细胞中钙的储存和释放（Phillips & Voeltz, 2016；Serano等，2025）。此外，溶酶体作为重要的次级Ca2?储存库也受到了广泛研究。这些细胞器含有高浓度的Ca2?，对于维持细胞内钙稳态和调控下游信号转导至关重要。TRPML1是特异性表达于溶酶体膜上的阳离子通道，是一种六次跨膜四聚体通道，对Ca2?及其他阳离子具有通透性（Wu等，2021）。据信它是介导溶酶体Ca2?释放的主要通道，在溶酶体信号传导中发挥重要作用（Chen等，2017）。其N端结构域作为氧化还原传感器，在氧化应激条件下可被活性ROS直接且特异性地激活，导致通道开放和溶酶体Ca2?释放至细胞质中（Zhang等，2016）。ML-SI3是一种小分子抑制剂，通过竞争性结合TRPML1的疏水空腔来特异性靶向TRPML1通道，从而使通道稳定在关闭构象，有效阻止溶酶体Ca2?外流（Schmiege等，2021）。屠宰后，死后缺氧和缺血在肌肉组织中诱导氧化应激（McGuire等，2011），导致细胞内ROS积累。这触发了溶酶体TRPML1，促进Ca2?从溶酶体释放至胞质中。TRPML1介导的溶酶体钙释放并非简单地扩散至肌浆，而是通过建立与线粒体的膜接触位点，将Ca2?定向转移至线粒体，调控线粒体的钙动态平衡（Peng等，2020）。持续的Ca2?内流可能导致线粒体Ca2?超载、膜稳定性降低和MPTP开放（D'Angelo等，2023）。线粒体膜通透性增加促进Cyt-c释放至细胞质，在那里Cyt-c与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合并使其激活（Tait & Green, 2013）。活化的Apaf-1通过其caspase招募结构域（CARD）招募procaspase-9，触发caspase-9的自催化活化，随后切割并激活caspase-3，最终导致凋亡（Guicciardi等，2000）。

近年来，溶酶体介导的凋亡通路已成为研究热点。已有研究表明，溶酶体腔内的游离Fe2?在氧化应激下可通过Fenton反应产生羟基自由基，随后攻击线粒体并启动溶酶体-线粒体凋亡信号通路——这一机制在旨在改善肉质嫩度的研究中得到了证实（Li & Fan等，2025；Wang等，2024；Zhang等，2020）。此外，当溶酶体受到氧化应激时，其膜完整性受损，导致一系列水解酶释放至胞质中，其中组织蛋白酶最为关键（Chang等，2022）。研究表明，组织蛋白酶B可通过正反馈环路诱导LMP，进一步加剧溶酶体破裂（Werneburg等，2002；Zhao等，2010）。而且，组织蛋白酶可切割促凋亡蛋白Bid生成其截短形式tBid，后者具有膜插入活性。tBid随后转位至线粒体外膜，促进Cyt-c等促凋亡因子的释放，从而激活caspase-9和caspase-3级联反应，启动细胞死亡信号（Appelqvist等，2012；Ma等，2022；Zhao等，2010）。同时，作为溶酶体-线粒体凋亡通路的关键枢纽，组织蛋白酶D已被证明可促进Esox lucius肌肉死后熟成过程中的肉质嫩化（Li & Fan等，2025）。然而，溶酶体Ca2?释放介导的细胞死亡在死后熟成过程中对肉质（嫩度、WHC和色泽）的调控作用尚未见报道。

值得注意的是，尽管屠宰后血液循环立即停止且氧气供应中断，但肌细胞并不会立即死亡，而是经历信号活性的逐渐衰减。尽管最终会导致细胞死亡，但细胞内信号转导——包括线粒体相关凋亡通路，以及基因转录和蛋白翻译——在死后早期至中期的某一时间窗口内仍能响应外界刺激，并介导各种生物学反应（Sanoudou等，2004；Zhang等，2017）。这为将成熟的细胞器串扰机制（如溶酶体-线粒体Ca2?信号轴）从活细胞系统应用于死后肌肉模型提供了合理的生物学基础。因此，本研究考察了溶酶体和线粒体的局部细胞环境，并利用ML-SI3选择性抑制TRPML1通道，从而阻断溶酶体Ca2?释放。以溶酶体通道蛋白TRPML1为起点，我们旨在阐明氧化应激诱导的溶酶体Ca2?释放介导的线粒体细胞死亡对肉质的影响。

**实验方案概要**

**样本预处理** 选取6只6月龄、体重相近的滩羊，在相同的饲喂和管理条件下，接受一致的药物护理和卫生管理。放血屠宰后，从每只羔羊快速取出约800 g背最长肌。随后，肌肉样本去除可见脂肪和结缔组织，然后切割成约5 cm × 5 cm × 2.5 cm的均匀小块，每块重约50 g。

**ROS含量** ROS是氧的单电子还原产物的一组，包括自由基（O??·、·OH、RS·、ROO·等）和非自由基物质（H?O?、ROOH等）（Singal等，1998）。在肌肉组织中，ROS可通过键断裂和电子转移反应产生。在正常生理条件下，机体的抗氧化系统能有效清除多余的ROS，维持ROS产生与清除之间的动态平衡。然而，环境变化

**结论** 本研究测定了ROS、TRPML1以及线粒体钙含量、钙蛋白酶活性、MPTP吸光度、胞质还原型Cyt-c水平、caspase活性和肉质参数的表达水平。结果表明，在羔羊肉死后熟成过程中，氧化应激诱导溶酶体通透化，导致Ca2?释放，随后作用于线粒体，引起线粒体膜通透性改变，促进Cyt-c

**CRediT作者贡献声明** Junqin Wu：可视化，数据整理。Lin Su：监督，项目管理。Julong Zhou：可视化。Lihua Tang：监督，资源。Songlei Wang：软件，资源。Yulong Luo：写作——审稿与编辑，监督，方法论，资金获取，概念化。Songmin Cao：监督，资源。Yushan Dong：写作——审稿与编辑，方法论，调查，形式分析，概念化。Jiayu Wang：写作——审稿与编辑，写作——原稿。

**未引用参考文献** Li等，2025；Li等，2025；Nelson and Traub, 1982；Wang等，2021。

**伦理声明** 本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：《科技伦理审查办法（试行）》（国科发建〔2023〕167号）和GB/T 35892-2018《实验室动物福利伦理审查指南》。本研究已获宁夏大学科学技术伦理委员会批准（批准号：NXU-2024-271）。

**数据可用性** 数据可根据要求提供。

**利益冲突声明** 作者声明不存在利益冲突。

**竞争利益声明** 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本论文所报道的工作。

**致谢** 本研究得到国家自然科学基金（32460612）、宁夏自然科学基金（2025AAC050011）、宁夏回族自治区重点研发计划项目（2024BBF02023）、内蒙古自治区科技计划项目（2025YFDZ0042, 2025YFDZ0078）的资助。此外，我们感谢所有参与审稿的审稿人，以及MJEditor（www.mjeditor.com）提供的英文编辑服务。

Jiayu Wang|Yushan Dong|Junqin Wu|Julong Zhou|Lin Su|Songlei Wang|Lihua Tang|Songmin Cao|Yulong Luo

宁夏大学食品科学与工程学院，银川 750021，中国