PROSS辅助工程提高了可降解AFB1的超氧化物歧化酶的热稳定性和储存稳定性

《Food Bioscience》：PROSS-Assisted Engineering Enhances the Thermal and Storage Stability of an AFB 1-Degrading Superoxide Dismutase

　　

摘要

黄曲霉毒素B₁（AFB₁）污染威胁饲料安全，凸显了酶法脱毒策略的必要性。本研究分离并鉴定出一株AFB₁降解菌株HNGD-122，该菌株鉴定为与巨大芽孢杆菌（Priestia megaterium）相关的菌株。通过基因组指导挖掘，鉴定出一种具有AFB₁降解活性的超氧化物歧化酶（SOD）。为提高酶稳定性，采用PROSS辅助设计策略，获得了M163K突变体。M163K保留了AFB₁降解活性，且热稳定性显著增强，在70和80 °C下的半衰期分别延长至32.2和20.7小时。在4 °C储存及冷冻干燥后，其AFB₁降解速率均高于野生型（WT）-SOD。分子动力学模拟表明，M163K在维持SOD–AFB₁相互作用的同时，通过增强局部稳定化相互作用提高了热稳定性。在斑马鱼实验中，M163K处理后降低了发育毒性和氧化应激水平。在天然污染的玉米粉和玉米糠中，M163K分别降解了约66.5%和61.9%的AFB₁，支持其在玉米基饲料原料中AFB₁控制方面的应用潜力。

章节摘要

引言

粮食等主要农产品中的真菌毒素污染仍是全球面临的重大挑战，其中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）尤为值得关注（Eskola等，2020）。AFB₁主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）产生，是农产品中最危险且分布最广的真菌毒素之一。鉴于其对人类的致癌风险已得到充分证实，AFB₁被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物（Arsenide等

AFB₁降解菌株HNGD-122的分离、筛选与鉴定

为分离具有潜在AFB₁降解活性的细菌菌株，从中国河南省及周边地区采集了216份样品，包括玉米、花生田土壤、霉变玉米、发酵食品、动物粪便和腐烂水果等。简要流程如下：将每份样品各取5.0 g，悬浮于45 mL无菌生理盐水中，于37 °C、180 rpm振荡培养2–4小时。随后，取200 μL悬浮液涂布于以香豆素为唯一碳源的基底盐琼脂平板上进行富集

菌株HNGD-122的分离、筛选与鉴定

生物学方法为控制和减少食品与饲料系统中的黄曲霉毒素污染提供了一种相对温和且可持续的途径（Guan等，2021）。利用2.1节所述的筛选流程，从216份环境样品中获得了数株候选分离菌株。其中，HNGD-122表现出最高的AFB₁降解活性，因此被选为深入研究对象。香豆素是一种含有内酯环的结构类似物，被用于初步富集

结论

总之，本研究从花生田土壤中分离出一株新的AFB₁降解菌株HNGD-122，并从该菌株中鉴定和功能性验证了一种具有AFB₁降解活性的SOD。随后，采用PROSS辅助蛋白质工程策略获得了M163K变体，该变体在很大程度上保留了AFB₁降解活性，同时表现出显著改善的热稳定性、储存稳定性和冷冻干燥耐受性。分子动力学模拟表明，增强后的

CRediT作者贡献声明

杨雨慧：方法论。Fred Mwabulili：撰写——审阅与编辑，方法论。张一谦：撰写——审阅与编辑，方法论。张研：撰写——初稿，软件，方法论，形式分析，数据管理。Antonio Francesco Logrieco：方法论。谢艳丽：撰写——审阅与编辑，可视化，监督，方法论，经费获取，概念设计

未引用参考文献

Benkerroum, 2020; Hollingsworth and Dror, 2018; Lyagin and Efremenko, 2019; Rushing and Selim, 2019.

伦理声明

本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经郑州大学动物伦理委员会批准。（批准编号：ZZUIRB2022-92）

伦理声明

本实验参照"CCAC指南：斑马鱼及其他小型温水实验室鱼类"和"斑马鱼在研究、教学和检测中的使用指南"，并严格遵循其对斑马鱼实验室动物的伦理要求。本实验经郑州大学机构动物护理和使用委员会批准（许可编号：ZZUI RB 2022-92）。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能影响本文所报告的工作。

利益冲突声明

√作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究由国家重点联合基金、国家自然科学基金委员会（编号：U24A20473）、河南省重点研发项目（编号：231111113300）以及河南工业大学托鑫团队培育项目（编号：2024TXTD08）资助。

张研|张一谦|Fred Mwabulili|杨雨慧|谢艳丽|Antonio Francesco Logrieco

河南工业大学食品科学与工程学院，河南省粮油食品安全与营养重点实验室，中国郑州，450001