利用超声辅助蛋白酶-谷氨酰胺酶脱酰胺修饰的聚集米糠蛋白制备高内相类乳液

《Food Hydrocolloids》：Fabricating a high internal phase-like emulsion using aggregated rice bran protein modified by ultrasound-assisted protein-glutaminase deamidation

　　

# 摘要

鉴于稳定液态油凝固系统的发展需求以及大尺寸聚集蛋白质在应用中存在的局限性，本研究探讨了蛋白质谷氨酰胺酶（PG）脱酰胺结合超声改性对聚集稻米糠蛋白（AP）结构及高内相类（HIP类）乳状液体系稳定性的调控作用。系统表征了AP的结构特性、界面特征以及HIP类乳状液的宏观性能。结果表明，脱酰胺诱导AP分子构象展开，促进了β-折叠向β-转角结构的转变，并略微增加了表面负电荷密度。超声调控了AP的聚集状态，促进了均匀可控的蛋白质聚集体形成。此外，超声与脱酰胺的协同作用使AP形成了结构良好的聚集体，显著改善了表面疏水性和界面膜强度，为优化乳状液的三维网络结构奠定了结构基础。改性后的AP HIP类乳状液油相体积分数约为60%，离心稳定性增强，流变性能优异。综上所述，超声与脱酰胺的联合改性可通过调控AP的构象和聚集状态来增强界面膜形成并构建稳定的三维网络结构，从而有效提高HIP类乳状液的稳定性和可塑性。具体而言，脱酰胺在调控乳状液性能方面起主导作用。本研究为大尺寸聚集植物蛋白的利用以及高性能植物蛋白基液态油凝固系统和低脂食品的开发提供了理论基础。

# 引言

过量摄入动物脂肪已被确认为增加心血管疾病和肥胖风险的重要因素，食品行业对低热量、植物基动物脂肪替代品的需求持续增长（Manzoor等，2022；W. Zhao等，2022）。液态油凝固系统被视为脂肪替代品开发的核心策略，包括高内相乳状液（HIPE）、乳液凝胶和脂肪醇凝胶。然而，所有这些方法均存在限制其实用性的固有缺陷。首先，HIPE要求油相体积分数不低于74%，因此产生高热量的产品，无法满足健康饮食的低脂要求（K. Li & Meng，2026）。其次，乳液凝胶的凝固是通过加热或酶促交联实现的，该过程诱导蛋白质变性和网络形成，这不仅增加了能源消耗，还促进了不饱和脂肪酸和热敏感营养素的氧化降解（Zhou等，2025）。第三，蜡和脂肪酸酯等添加剂常被引入脂肪醇凝胶中以维持三维网络结构，这与当前食品产品的清洁标签开发趋势相冲突（J. Guo等，2023）。

基于蛋白质的乳化剂因其天然来源、高安全性和良好的营养特性而被视为液态油凝固的理想原料。其中，大豆蛋白、豌豆蛋白和乳清蛋白得到了广泛研究（Shao & Tang，2016；Amagliani & Schmitt，2017；Hei等，2024；F. Guo等，2025；H. Li等，2025）。然而，提高这些蛋白质的界面活性通常需要复杂的或剧烈的改性过程，且原料成本高昂，无法满足食品行业对低成本植物基乳化剂的需求。因此，开发具有中等油相含量的低成本、绿色和清洁标签植物基液态油凝固系统已成为食品胶体领域的一个关键研究焦点。

稻米糠是大米碾磨过程中产生的副产品，因其蛋白质含量高且具有多种生物活性功能而被确认为一种极具前景的低成本植物蛋白资源（H.-J. Zhang等，2012；Y. Yu等，2022）。稻米糠蛋白（RBP）具有卓越的营养特性，这使其区别于其他植物蛋白。它含有全部八种必需氨基酸，组成与FAO/WHO推荐模式紧密匹配。此外，RBP特别富含赖氨酸，这是一种在常见谷物蛋白中经常缺乏的必需氨基酸。此外，RBP具有高消化率，也被认为是一种适合用于婴儿配方食品的低致敏性蛋白成分（Han等，2015）。然而，RBP在食品工业中的应用受到固有功能缺陷的严重限制，包括溶解度低和乳化性能差（Fabian & Ju，2011）。目前，RBP的改性策略得到了广泛研究，大多数研究集中在全蛋白组分的功能性质优化和利用上（F. Li等，2021；Ling等，2019；Y. Luo等，2023；Sharma等，2023；X. Yu等，2023）。已有文献记载，通过物理、化学和酶处理等改性方法可以显著增强植物蛋白的功能性质（Suppavorasatit & Cadwallader，2012a；Ling等，2019；F. Li等，2021；X. Yu等，2023）。尽管在此过程中RBP的溶解度得到了相当大的改善，但部分以AP为特征的大粒径、分散性差的组分仍然难以被有效利用（L. Zhang等，2026）。值得注意的是，溶解度差和难以利用的聚集组分这一问题并非RBP所独有。大多数植物蛋白，包括大豆蛋白和豌豆蛋白，也面临溶解度有限的问题，虽然其可溶组分可以有效利用，但不溶性聚集组分往往被丢弃或用于低价值的用途。RBP因其本身溶解度低和强烈聚集倾向，直接作为乳化剂使用尤为困难。这是由于AP具有大粒径、快速沉降和高空间位阻的特征，导致其需要更长的油水界面平衡时间，从而表现出缓慢的吸附速率和高的界面张力，使其很难有效稳定油水界面（K. Li & Meng，2026）。此外，据报道，改性后的RBP已被用作乳化剂以稳定油水系统，但RBP在油水界面的稳定吸附仍然依赖于额外的添加剂或优异的界面性质（X. Han等，2026）。因此，开发一种策略将这些难以处理的聚集蛋白组分转化为功能性乳化稳定剂，不仅具有重要的科学价值，也可能为功能性质较差的其他植物蛋白的聚集组分的利用提供有价值的参考。在这些蛋白改性方法中，蛋白质谷氨酰胺酶（PG）具有高特异性和温和反应条件的特点，已在*Chryseobacterium proteolyticum* 9670T中被发现（Yamaguchi & Yokoe，2000；Yamaguchi等，2001）。PG可以使蛋白质侧链上的谷氨酰胺残基脱酰胺，转化为带负电荷的羧基。这种转变可以显著改善蛋白质的溶解度、乳化能力和发泡性质等功能特性，并已被应用于多种植物蛋白（Kunarayakul等，2018；Luo等，2023；Li等，2025；Liu等，2026；Ma等，2026；C. Wang等，2027）。

尽管单独使用超声可以破碎AP聚集体，但暴露的疏水基团在热力学驱动力下倾向于重新聚集。同样，单独使用PG脱酰胺主要改善可溶的DP组分，但由于AP的致密结构，其可及性有限。联合方法通过整合各方法的优点克服了这两方面的局限性。超声预处理破坏聚集结构并为后续PG改性暴露更多作用位点，而脱酰胺引入的羧基抑制疏水性重新聚集，从而使AP形成稳定的界面膜。基于之前的研究，为实现DP回收后剩余的大量AP的再利用，本研究以超声预处理PG脱酰胺改性产生的AP作为原料（L. Zhang等，2026）。在PG脱酰胺之前，应用低功率超声物理破坏AP聚集体。然后，使用较高功率超声作为乳化方法来制备乳状液。无需热变性，仅通过低速离心去除部分水即可成功制备出低热量高内相类（HIP类）乳状液体系，油相比例仅为60%，但表现出凝胶状质地、自支撑能力和可塑性。此外，通过阐明AP结构和界面性质的变化，系统探索了超声和脱酰胺对乳状液性能的调控作用，并阐明了大粒径AP稳定油水界面的机制。需要注意的是，本研究在三个方面与我们此前关于基于DP的脂肪醇凝胶的工作有所不同。第一，所使用的蛋白组分不同：此前研究利用可分散的DP组分，而本研究聚焦于聚集的AP组分。第二，构建方法有所改进：使用低速离心而非长时间烘干，且不需要热变性步骤，可以在室温下快速制备。第三，凝固机制不同：此前的脂肪醇凝胶依赖于热变性诱导的蛋白质网络形成，而本研究的HIPE类乳状液通过超声预处理和脱酰胺的协同作用以及物理离心浓缩实现了凝固。本研究不仅为稻米糠加工副产品的高值化利用提供了新策略，还突破了传统乳状液稳定理论对乳化剂粒径和界面活性的限制。此外，本工作为低热量植物基脂肪替代品产品的开发提供了理论支持和技术参考。

# 材料与方法片段

## 材料

RBP（蛋白质含量85.2%）购自陕西先锋生物科技有限公司（陕西，中国）。橄榄油购自春雨坊食品有限公司（河北，中国）。PG（80 U/mL）按照此前报道的方法由*Chryseobacterium proteolyticum* 3D9K发酵纯化获得（L. Wang等，2023；Zhang等，2023）。

## AP的制备

实验方法和参数设置基于之前的研究和初步实验确定（如图S1所示）（L. Zhang等，2026）。RBP粉末中AP占整个RBP体系的比例如图1A所示，在超声预处理和PG脱酰胺后表现出不同的变化。天然AP（0W-0%）的AP含量为88.6%，在单独脱酰胺组（0W-10%）中降至83.8%，在单独超声组（180W-0%）中升至90.7%，在联合处理组（180W-10%）中回至87.0%。PG可催化谷氨酰胺残基转化为带负电荷的谷氨酸，增强分子间静电排斥并破坏……

# 结论

为解决稻米糠利用不足以及聚集蛋白作为乳化剂应用受限的问题，本研究通过分级分离实现了RBP中AP组分的靶向利用，并系统阐明了超声、PG脱酰胺及其联合改性对AP结构演变和HIPE类乳状液性能的调控作用。

在蛋白构象方面，超声破碎了天然聚集体并诱导……

# CRediT作者贡献声明

张冲：撰写-审阅与编辑，监督，项目管理。李光华：监督，项目管理。山凯：软件，方法学，形式分析。王婷：方法学，形式分析。韩新怡：撰写-原稿，可视化，方法学。张璐：撰写-原稿，软件，方法学，形式分析，概念化。

# 未引用参考文献

Li等，2025；Li等，2025；Liu等，2026；Liu等，2025；Luo等，2023；Miwa等，2010；Suppavorasatit和Cadwallader，2012b；Zhang等，2021；Zheng等，2023。

# 利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文中报告的工作。

# 数据可用性

支持本研究结果的所有数据均包含在本文及其补充数据文件中。

# 利益冲突声明

? 作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文中报告的工作。

# 致谢

本工作由淮原糯稻研究所项目（61TQ260001）和江苏省研究生科研与创新计划2025（KYCX25_1026）资助。

张璐 | 韩新怡 | 王婷 | 山凯 | 李光华 | 张冲
南京农业大学食品科学与工程学院，南京210095，中国