等功能性蛋白提取物与着色共产物：迈向集成化微藻生物加工

《Food Hydrocolloids》：Functional protein extracts and colouring co-products from Chlorella fusca: Towards integrated microalgal bioprocessing

　　

摘要：对可持续高品质蛋白质来源日益增长的需求引发了人们对微藻作为传统蛋白质替代品的关注。本研究旨在筛选最适于蛋白质提取与利用的小球藻（*Chlorella*）菌株，并优化细胞破碎及提取条件以最大化蛋白质回收率与功能性。在评估的5株小球藻中，*Chlorella fusca*（褐球藻）表现出最高的生长速率（0.16 d^?1）和生物量产率（83.55 mg·L^?1·d^?1），因此被选作后续实验材料。细胞壁破碎优化结果表明，在100 g·L^?1浓度下破碎效率最高，但出于实用性考虑采用10 g·L^?1。蛋白质提取在溶解pH 11.90和沉淀pH 3.40条件下达到最优，蛋白质含量为44.63 g·100 g^?1生物量。提取的蛋白质表现出良好的乳化能力（pH 10时高达66.1 ± 0.2%）和起泡能力（pH 2时为78.6 ± 0.1%），以及较高的持水性和持油性（分别为2.5 ± 0.2和3.3 ± 0.3 g·g^?1）。凝胶仅在20%蛋白质浓度且碱性pH条件下形成。氨基酸谱分析显示，必需氨基酸占总氨基酸的45.7%，与常见富蛋白食品提取物报道值相当。此外，蛋白质提取残余物在食品基质中表现出强着色潜力，尤其是翻糖和意大利面制品中的绿色色调。总体而言，这些发现凸显了*C. fusca*作为食品和营养保健应用中功能性蛋白质和天然色素可持续微藻来源的潜力。同时，提取残余物作为天然着色剂的增值化利用强化了微藻生物精炼的循环和零废弃潜力。

**论文解读：基于*Chlorella fusca*的功能性蛋白提取与着色副产物利用——迈向集成化微藻生物加工**

**一、研究背景与问题**

全球人口增长和膳食结构升级使优质蛋白质需求持续攀升，传统动物源蛋白生产面临巨大的环境压力，包括高温室气体排放、土地和水资源密集消耗等问题。植物蛋白虽作为替代方案受到关注，但微藻相较传统植物蛋白来源具有多重优势：蛋白质含量更高、生长速率更快、可在严苛条件下生长、不依赖耕地和季节条件，且氨基酸（AA）谱更均衡。然而，微藻蛋白的高效提取与表征仍面临重大挑战。一方面，微藻细胞壁结构坚韧，需有效破碎才能释放胞内蛋白；另一方面，蛋白质溶解度因物种和加工条件差异而波动显著。已有研究多集中于*Chlorella vulgaris*和*Arthrospira platensis*等有限物种，且大多停留在基础成分分析层面。将细胞破碎效率、蛋白质回收优化和蛋白组分功能表征进行系统整合的研究仍十分匮乏。此外，蛋白提取过程中产生的残余生物质常被忽视，其作为天然色素或其他高值化合物的潜在价值未得到充分利用。为解决这些空白，本研究采用集成生物精炼策略，同时涵盖菌株筛选、工艺优化、蛋白功能性、营养品质和副产物增值利用，对*C. fusca*进行全面评价。

**二、主要技术方法**

研究人员首先在完全受控的300 mL鼓泡柱光生物反应器中，以批次模式培养5株小球藻（*Chlorella* sp. BEA 0236B、*C. vulgaris* MACC-755、*C. saccharophila* UTEX 2911、*C. vulgaris* MACC-1和*C. fusca* BEA 1005B），每个光生物反应器作为实验单元，通过干重法和680 nm光密度（OD₆₈₀）相关性曲线监测生物量浓度，筛选生长性能最优菌株。随后，利用UP400S超声处理器（400 W，24 kHz）在不同生物量浓度（1、10、100 g·L^?1）下进行细胞壁破碎效率评价，通过离心后上清液OD₆₈₀评估破碎效果，并以光学显微镜观察作为定性佐证。蛋白质回收采用等电点溶解/沉淀策略，先以3个溶解pH（10、11、12）×3个沉淀pH（2、3、4）的组合进行24 h正交试验，利用等高线图确定最优pH条件，再在此基础上评价不同溶解/沉淀时间（1、2、3、4、24 h）的影响；蛋白质含量通过Elementar Rapid N元素分析仪测定总氮含量并以6.25转换系数计算。技术功能性质测定包括：溶解性（pH 2?12）、乳化能力（EC）与乳化稳定性（ES）、起泡能力（FC）与泡沫稳定性（FS）、凝胶能力（最低凝胶浓度）、持水性（WHC）和持油性（OHC）。氨基酸组成采用6 M HCl在110 ℃水解24 h后经HPLC-荧光检测器分析。蛋白提取残余物添加到多种食品基质（翻糖、巧克力、焦糖、冰淇淋、意面、明胶、奶油等）中，通过与商用绿色产品对比，采用C400色度计测量L\*、a\*、b\*参数并计算色差ΔE\*，评价其作为天然着色剂的潜力。统计分析采用方差分析（ANOVA）、Shapiro-Wilk检验、Levene检验和Tukey事后检验。样本来源于实验室培养，无临床样本队列。

**三、研究结果**

**3.1 微藻生长与菌株筛选**

在第21天，*C. fusca*的生物量浓度达到1.75 ± 0.07 g·L^?1，比生物量积累最低的*Chlorella* sp.（0.94 ± 0.03 g·L^?1）高86%。*C. fusca*具有最高的比生长速率（0.232 ± 0.006 d^?1）和生物量产率（86.2 ± 3.1 mg·L^?1·d^?1），与文献报道的*C. fusca*及其他商业相关微藻物种相比处于较高水平。基于此，*C. fusca*被确定为蛋白质提取的最适菌株。

**3.2 蛋白质回收**

细胞壁破碎效率随生物量浓度增加而提高，100 g·L^?1时破碎效率最高且单位能耗最低。然而，考虑到高浓度带来的黏度和操作困难，后续实验采用10 g·L^?1以平衡破碎效率与工艺可行性。蛋白提取优化通过等高线图确定了最优条件：溶解pH 11.90、沉淀pH 3.40。时间优化实验表明，1?24 h的溶解和沉淀时间对蛋白回收率无显著影响，因此采用1 h溶解和1 h沉淀以最大限度减少碱性条件下的蛋白质降解和消旋化。在最优条件下，最终蛋白含量达44.63 g·100 g^?1生物量；元素分析显示提取物氮含量为11.08 ± 0.20%，对应蛋白质含量69.24 g·100 g^?1，与总氨基酸含量（68.48 g·100 g^?1）高度一致，表明提取物以蛋白质为主要成分。

**3.3 蛋白质组成与功能性**

蛋白质溶解度在pH 12时最高（99.7 ± 0.8%），pH 4时最低（3.1 ± 3.6%），这归因于pH改变蛋白质净电荷从而影响静电排斥与聚集。乳化能力随pH升高而增强，pH 10时达到最大值66.1 ± 0.2%；乳化稳定性在pH 8和10最高（分别为92.3 ± 1.0%和92.7 ± 2.2%），pH 4时最低。此结果表明蛋白提取物在中性至碱性环境中具有优异的乳化性能，适用于沙拉酱、蛋黄酱等乳化食品体系。起泡能力在pH 2时最高（78.6 ± 0.1%），pH 4时最低（42.3 ± 4.0%）；泡沫稳定性在酸性条件下更优，pH 2时60分钟泡沫稳定性为40.4 ± 2.1%，而pH 8和10分别在110分钟和100分钟完全坍塌。WHC和OHC分别为2.5 ± 0.2和3.3 ± 0.3 g·g^?1，其中OHC优于多种植物蛋白分离物。凝胶仅在20%蛋白浓度且pH 8和10条件下形成，最低凝胶浓度（20%）高于大豆（12%）、豌豆（15%）和*C. vulgaris*（10?12%），说明凝胶效率相对较低，可能与提取物纯度较低和蛋白组成差异有关。氨基酸分析显示，提取物含有WHO/FAO推荐的9种必需氨基酸的全部种类，必需氨基酸总量为31.3 g·100 g^?1蛋白，占总氨基酸的45.7%，与大豆（32.6 g·100 g^?1）和奇亚籽（29.4 g·100 g^?1）接近；赖氨酸、苏氨酸和缬氨酸达到或接近参考值；亮氨酸和蛋氨酸相对较低，这一模式在植物源蛋白中常见。非必需氨基酸中，谷氨酸+谷氨酰胺（8.52 g·100 g^?1）和精氨酸（8.51 g·100 g^?1）最为丰富，高精氨酸含量对心血管健康和免疫调节具有积极意义。

**3.4 蛋白提取残余物的着色能力**

蛋白提取残余物在不同食品基质中表现出差异化的着色潜力。在翻糖基质中，Forest Green色号在8.5%添加量时ΔE达到最小值4.82，该值低于5，表明即使经验丰富的观察者也无法辨别人眼差异，实现了与商用参考色号的视觉等效；Botanical Green在1.6%时ΔE最小值为5.41，属于可感知但非显著的颜色差异范围（5 ≤ ΔE < 12）。在冰淇淋基质中，开心果口味在0.62%添加量时ΔE最小值为17.40，薄荷口味在该浓度下ΔE为11.96，中等添加量可有效缩小色差。在意大利面基质中，ΔE在0.38%添加量时达到最小值9.60，虽未实现完全匹配但已进入明显颜色变异范围。而在巧克力（最低ΔE 22.92）和明胶（最低ΔE 16.47）基质中，所有测试浓度下的ΔE均大于12，颜色差异肉眼可辨，表明上述基质中无法实现良好的颜色匹配，可能与残余物色素组成与目标商用色素的差异有关。在开心果饼干奶油基质中，ΔE从39.17降至3.6%时的10.85，但即使最小值仍大于5。总体而言，蛋白提取残余物在翻糖和意大利面等基质中表现出接近商用绿色产品的着色能力，可作为合成染料的可持续替代品。但在巧克力、焦糖和明胶中颜色匹配能力有限，说明色素谱系与特定商用色调的兼容性仍需优化。

**四、结论与展望**

本研究成功建立了从菌株筛选到功能表征及副产物回收的*C. fusca*生物质全利用集成路径。*C. fusca*凭借其优异的生长性能和生物量产率被确定为最具应用潜力的菌株。碱溶（pH 11.90）—酸沉（pH 3.40）策略结合超声辅助破碎实现了44.63 g·100 g^?1生物量的蛋白含量，证实了提取策略的高效性。提取蛋白在起泡性（78.6 ± 0.1%）、乳化活性（最高66.1 ± 0.2%）及中碱性条件下的乳化稳定性方面表现优异，同时具有相当的持水持油能力和在特定条件下形成凝胶的能力。必需氨基酸组成（31.3 g·100 g^?1蛋白）可与大豆、奇亚籽等主流植物蛋白源相媲美，支持其作为食品配方中替代蛋白原料的可行性。特别值得关注的是，蛋白提取残余物在翻糖基质中实现了ΔE低至4.82的着色效果，其与商用参考色号在视觉上无法区分，证明这些通常被视为废物的残余物能够被重新增值为天然绿色色素。该研究将蛋白质提取与副产物增值相整合，完全契合循环生物经济原则，为多产品微藻生物精炼的设计奠定了理论与实践基础。论文发表在《Food Hydrocolloids》，为微藻基功能性蛋白原料和天然色素的可持续开发提供了重要的技术支撑和理论依据。