益生菌植物乳植杆菌GXS77促进Caco-2单层细胞中的上皮钙转运

《Food Bioscience》：Probiotic Lactiplantibacillus plantarum GXS77 Promotes Epithelial Calcium Transport in Caco-2 Monolayers

　　肠道钙吸收是矿物质稳态的核心环节，但目前将益生菌来源的短链脂肪酸与上皮钙转运直接联系起来的株水平证据仍然有限。在此，我们对一株具有与益生菌相关的体外特征的候选菌株乳植物杆菌GXS77进行了表征，采用了全基因组分析、胃肠道耐受性检测、Caco-2黏附试验、抗菌活性测定、CCK-8活性检测、短链脂肪酸定量、Fluo-4 AM钙成像、RNA测序以及Western印迹。GXS77在模拟胃液中的存活率为83.18%，在模拟肠液中的存活率为60.26%，对分化后的Caco-2单层细胞的黏附率为28.6%。其无细胞上清液可抑制单核细胞增生李斯特氏菌（抑菌圈大于5 mm）、沙门氏菌属（2–5 mm）以及金黄色葡萄球菌（0–2 mm），而活菌处理相对于对照组并未降低CCK-8信号。经48小时发酵后，GXS77产生了10.95 g/L的乙酸和0.14 g/L的丁酸。GXS77的无细胞上清液以及等量的短链脂肪酸混合物均能增强细胞内钙响应，效果优于pH匹配的对照组，表明其作用超出了单纯的酸化效应。RNA测序鉴定出108个满足|log?FC| > 1且经Benjamini-Hochberg校正的p < 0.05的基因，并富集了异生物、类固醇激素、视黄醇及其相关代谢通路。Western印迹确认了钙结合蛋白-D9k、TRPV6和Claudin-2表达水平的升高，支持跨细胞和旁细胞钙转运途径均被激活。这些发现提供了一个将GXS77来源的代谢物与上皮钙转运联系起来的体外分子框架。钙是一种必需矿物质，参与肌肉收缩、血液凝固和细胞内信号传导。钙摄入不足或吸收不良仍然是一个营养问题。尽管无机钙补充剂应用广泛，但其使用可能受到胃肠道不良反应的限制。在肠道界面改善钙处理策略值得关注。体外上皮模型为研究钙摄取和转运机制提供了受控系统，但并不能确定其对骨健康或临床结局的影响。胃肠道是膳食钙摄取的主要部位。钙通过两条互补途径穿过肠道上皮：一是主动的跨细胞途径，涉及顶膜进入、细胞内结合和基底外侧排出；二是被紧密连接通透性调控的被动旁细胞途径。植物乳杆菌属菌株尤其引人关注，因为某些分离株耐受胃肠道应激、黏附上皮表面，并能与宿主转录程序相互作用。除上皮相互作用外，含植物乳杆菌的干预措施以及更广泛的益生菌配方已在胃肠道和肠-脑相关背景下进行研究。报道的结局包括胃肠道症状的变化、炎症反应的变化以及与肠道微生物相关的行为表型变化。近期一项系统综述总结了益生菌植物乳杆菌的株特异性健康证据。这些效应仍取决于菌株、配方和实验模型，因此并未确立与GXS77可比的全身性或临床益处。在益生菌来源的代谢物中，短链脂肪酸，尤其是乙酸和丁酸，与上皮屏障调节、阳离子转运以及微生物维生素-矿物质代谢密切相关。传统上，它们对矿物质吸收的贡献被认为源于腔内酸化，从而提高钙的溶解度。越来越多的证据表明，短链脂肪酸还作为信号分子调节上皮基因表达和转运网络，从而将益生菌对钙处理的影响扩展到单纯的pH介导溶解之外。后生元研究进一步表明，乳酸菌来源的产品可改变上皮钙信号。植物乳杆菌已被证明与肠道上皮细胞中的Ca2?相关调控有关。这些观察结果引发了关于益生菌驱动的钙处理的两个关键问题。首先，应评估菌株来源的短链脂肪酸能否独立于培养基酸化而急性刺激上皮钙内流。其次，这种急性反应应与钙转运机制的长期调控联系起来，包括TRPV6、S100G/钙结合蛋白-D9k、VDR以及形成孔隙的紧密连接蛋白如Claudin-2。先前的研究已考察过植物乳杆菌或后生元相关的钙反应以及短链脂肪酸介导的肠道钙转运。然而，将一株已确定的植物乳杆菌分离株、其测定的短链脂肪酸产量以及pH匹配条件下的钙内流，与分化Caco-2单层中协调的转录组和蛋白质反应相连接的株特异性证据仍然有限。因此，本研究表征了候选植物乳杆菌GXS77，并考察了其对分化Caco-2单层中钙处理的影响。通过整合益生菌表型测定、短链脂肪酸定量、基于Fluo-4 AM的钙动力学、转录组分析以及蛋白质验证，我们旨在考察GXS77来源的代谢物如何在功能和分子层面影响上皮钙转运。具有益生菌相关体外特征的候选菌株植物乳杆菌GXS77（CGMCC No. 35899）分离自中国湖北的传统发酵腌菜汁。该菌株在de Man, Rogosa, and Sharpe（MRS）肉汤中，于厌氧条件下37°C培养。MRS培养基每升含10.0–12.0 g蛋白胨、8.0–12.0 g牛肉浸粉、3.5–4.5 g酵母浸粉、2.0–2.2 g柠檬酸铵、5.0–5.5 g乙酸钠、0.1–0.3 g MgSO?·7H?O、0.03–0.05 g MnSO?·4H?O、2.0–2.3 g K?HPO?。全基因组表征将GXS77鉴定为植物乳杆菌。最终组装包含六个环状复制子（一条染色体和五个质粒），总计3,470,527 bp，复制子长度加权GC含量为44.19%，N50为3,285,720 bp，预测开放阅读框3,297个，CheckM完整度99.38%，污染度0%。与NCBI RefSeq参考集进行的FastANI比较确定GCF_014131735.1为最接近的参考基因组，注释为植物乳杆菌。本研究将植物乳杆菌GXS77的益生菌相关表型与体外上皮钙转运联系起来。先前的研究已考察过植物乳杆菌或后生元相关的钙反应以及短链脂肪酸介导的肠道钙转运，而本研究将一株已确定菌株测定的乙酸和丁酸产量，与pH匹配条件下的钙内流，以及分化Caco-2单层中互补的转录组和蛋白质水平读出联系起来。本研究鉴定出植物乳杆菌GXS77作为一株具有与体外上皮钙转运相关的益生菌特征的候选菌株。菌株GXS77表现出益生菌相关的体外特征，包括耐受模拟胃液和肠液、黏附分化后的Caco-2单层、对代表性食源性病原菌的抗菌活性，以及在发酵过程中产生乙酸和丁酸的能力。功能性钙成像进一步显示……李新：写作——审阅与编辑、写作——原稿撰写、可视化、资金获取。唐金文：写作——审阅与编辑、写作——原稿撰写、可视化、数据管理。肖路：写作——审阅与编辑、写作——原稿撰写。刘文勇：监督、资金获取、概念化设计。作者没有权限共享数据。? 作者声明，他们没有任何已知的相互竞争的财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。我们感谢以下资助机构提供资金支持：广东省重点研发计划（编号：2023B0202030002）；中国博士后科学基金（2025M782991）；国家自然科学基金（22608190）；广州市科技计划项目（编号：2023B01J2004）；广东省重点研发计划（编号：2025B0202110004）。唐金文 | 肖路 | 李新 | 刘文勇华南理工大学食品科学与工程学院应用生物催化实验室，中国广东省广州市五山路381号，邮编510640