地衣芽孢杆菌259从畜禽软骨生产软骨素硫酸酯：底物筛选、发酵与代谢组学分析

《Food Bioscience》：Chondroitin Sulfate Production from Livestock and Poultry Cartilage by Bacillus velezensis 259: Substrate Screening, Fermentation, and Metabolomics Analysis

　　

摘要

为了确定适用于硫酸软骨素（CS）提取的软骨基质，并研究微生物发酵和降解前后软骨代谢变化的特征，本研究以鸡软骨、猪气管软骨和猪半月板软骨为原材料，利用地芽孢杆菌259（B. velezensis 259）发酵软骨以提取CS。首先，基于组织结构特征、降解率、CS得率、CS结构特征和CS功能性质，筛选了适合CS提取的软骨基质。随后，采用非靶向代谢组学分析鉴定发酵和降解前后鸡软骨中的差异代谢物及相关代谢通路。结果表明，鸡软骨在降解率和CS得率方面优于两种猪软骨，其CS粗提物表现出较高的综合功能活性。因此，进一步选择鸡软骨发酵和降解体系作为非靶向代谢组学分析的研究对象。代谢组学结果表明，差异代谢物主要与氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢相关。KEGG代谢分析结果表明，差异代谢物主要与多种代谢通路相关，包括组氨酸代谢和维生素B6代谢，提示B. velezensis 259发酵和降解鸡软骨前后发生了广泛的代谢变化。本研究为畜禽软骨资源的高值化利用和CS的绿色提取提供了新的研究思路。

引言

硫酸软骨素（CS）是一类天然酸性糖胺聚糖，广泛分布于动物软骨和结缔组织中。其基本结构由D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）交替连接形成的重复二糖单元构成，分子结构上附有硫酸基团（Shmagel等，2019；Wang等，2022）。根据硫酸化模式、来源等结构特征，CS可分为多种类型（Shmagel等，2019；Wang等，2022）。根据硫酸化位点的不同，CS可分为若干类型，其中CS-A（4-硫酸化硫酸软骨素）和CS-C（6-硫酸化硫酸软骨素）是最常见的类型（Lin等，2019）。不同来源和不同硫酸化模式的CS在分子量、结构特征和生物活性方面存在显著差异（Volpi，2019）。研究表明，CS具有多种生物活性，包括关节保护、抗炎、抗氧化、脂质代谢调节、肠道健康改善和组织修复等。因此，CS已被广泛应用于化妆品原料、药品、功能食品和生物医学材料中（Marcus，2017；Restaino & Schiraldi，2022；Shen, Zhang, Jia, Qin, Cui等，2019；Zhang等，2022）。近年来，全球对硫酸软骨素的需求持续增长，目前CS主要来源于动物软骨组织，包括牛、猪、鸡和鱼类（Shen等，2023）。

如今，全球畜牧业和肉类加工产业持续扩张。据联合国粮农组织（FAO）统计，2025年全球肉类产量达到3.87亿吨；经合组织-粮农组织《农业展望》报告预测，在人口增长、收入上升和城镇化推动下，全球肉类产量将在2030年代持续增长（FAO，2026；FAO，2025）。鉴于畜禽加工的巨大规模，仅家禽和猪肉加工产生的软骨资源即可达数百万吨。然而，大多数畜禽骨副产品被丢弃或用于饲料生产，其高值化利用仍非常有限。因此，从这些副产品中绿色高效地提取硫酸软骨素（CS）是实现其高值化利用的有效策略（Lasekan等，2012）。目前，常用的CS提取方法包括碱提取法、酶解法、碱-酶协同提取法、深共熔溶剂提取法和超声波辅助提取法（Abdallah等，2020；Schiraldi等，2010；Shen, Zhang, Jia, Qin, Xu等，2019；Tsai等，2023）。虽然传统提取方法可以促进CS释放，但通常存在试剂消耗量大、环境污染严重、提取效率和纯度有限以及工艺复杂等缺点（Abdallah等，2020；Schiraldi等，2010；Shen, Zhang, Jia, Qin, Xu等，2019；Tsai等，2023）。先前研究表明，不同提取方法获得的鸡软骨CS或含CS产品的得率存在显著差异，部分研究报告产品得率约为15%-36%（以干软骨为基准）（Le Vien等，2018）。相比之下，微生物发酵利用微生物的代谢活性液化软骨并释放CS，从而减少了对强酸、强碱和外源酶制剂的依赖。

微生物发酵方法可能利用微生物分泌的复杂酶体系，包括蛋白酶和多糖裂解酶，促进动物软骨中胶原-蛋白聚糖网络的降解，并促进CS释放到发酵液中。该方法具有成本低、工艺简单温和、产品质量稳定安全以及环保无污染等优点（Wu等，2013）。然而，关于不同软骨基质对CS提取效率的影响以及发酵过程中代谢特征的系统研究仍然有限。不同来源和解剖部位的软骨在组织结构、胶原含量和CS含量方面存在差异，这些差异共同影响微生物发酵和降解效率、CS得率以及所提取CS的结构和功能性质（Martel-Pelletier等，2015；Volpi，2007，2009）。目前关于不同来源CS提取的研究主要集中在提取得率和工艺优化方面，而对通过发酵降解提取的CS的结构、发酵特征和代谢组学研究仍显不足。非靶向代谢组学能够全面分析发酵前后产生的代谢物，从而表征微生物发酵过程中软骨基质代谢相关变化、关键代谢物的变化以及相关代谢通路（Chu等，2025）。因此，关于畜禽软骨资源中CS提取的研究对于推动副产品高值化利用和功能CS的开发具有重要意义。

基于此，本研究利用从传统发酵肉制品中分离鉴定出的具有胶原蛋白酶产生能力、安全性和益生菌潜力的地芽孢杆菌259（B. velezensis 259），研究了畜禽软骨发酵生产CS的基质筛选、发酵特征和代谢组学分析。通过评估不同软骨样本的组织学特征、CS得率、CS当量含量、紫外光谱和胆酸钠结合能力，筛选了适合CS提取的软骨基质。此外，采用非靶向代谢组学对选定软骨基质发酵过程中产生的代谢物进行了全面分析，阐明了发酵前后的代谢物变化，并鉴定了降解前后的主要差异代谢物及相关代谢通路。本研究为畜禽软骨资源的高值化利用和CS的环保提取提供了新的研究思路。

实验菌株

B. velezensis 259由河南农业大学食品科学技术学院微生物实验室提供。

原料

鸡软骨（CC）购自神农食品有限公司；猪气管软骨（PTC）和猪半月板软骨（PMC）均购自中国河南省郑州市金水区双汇超市。

试剂

LB肉汤和LB琼脂培养基（青岛海博生物科技有限公司）；4%多聚甲醛固定剂和BCA检测试剂盒（上海碧云天）

菌株纯化与富集

将-80°C保存的B. velezensis 259在室温下解冻，在LB琼脂培养基上纯化三代。取第三代单菌落接种至LB肉汤中，在37°C、160 r/min摇床中培养12-24小时，获得菌液。

与菌株降解相关的生物学特性

为确定胶原蛋白降解能力，使用无菌镊子将牛津杯放置于明胶培养基上并轻轻压入，之后加入200 μL B. velezensis 259菌液

菌株的生物学特性与安全性评价

如图S1(A)所示，B. velezensis 259菌落周围未观察到溶血环，表明其无溶血活性。如图S1(B)所示，B. velezensis 259菌落在明胶琼脂上周围出现明显透明圈，表明其具有降解胶原蛋白的能力。如图S1(C)所示，B. velezensis 259菌落在脱脂奶粉琼脂上周围出现明显透明圈，表明其具有降解蛋白质的能力。毒力与抗生素分析

结论

本研究建立了利用B. velezensis 259直接发酵畜禽软骨提取硫酸软骨素（CS）的微生物发酵方法。基于降解时间和所得CS粗提物的特征，筛选了合适的软骨基质，并进一步研究了鸡软骨发酵和降解前后的代谢变化及相关通路。结果表明，鸡软骨在

CRediT作者贡献声明

董梁：指导。李妙云：资源、资金获取。刘士杰：撰写-审阅与编辑、验证。丁一静：撰写-初稿、数据整理。孙玲霞：指导。刘燕霞：指导

未引用参考文献

Shen等，2019。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

资金支持

本研究得到了中原科技领军人才支持计划（254000510015）、国家自然科学基金面上项目（32472417）和河南省自然科学基金青年学生项目（252300423961）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

丁一静|刘士杰|李妙云|董梁|刘燕霞|孙玲霞

河南农业大学食品科学技术学院，郑州，450002，中国