在加工两种植物性甜点过程中分离出的广义枯草芽孢杆菌（Bacillus cereus sensu lato）菌株的发生情况、持续性及其致病潜力

《Food Microbiology》：Occurrence, persistence and pathogenic potential of Bacillus cereus sensu lato strains isolated during processing of two plant-based desserts

　　**摘要**
确保植物性食品的微生物安全性具有挑战性，尤其是在新产品开发过程中。本研究旨在绘制并识别两种植物性甜品（一种发酵型，一种非发酵型）生产过程中可能存在的宽氏芽孢杆菌（Bacillus cereus sensu lato, s.l.）污染物，以确定关键加工环节。研究人员对每种甜品的整个生产线进行了细菌检测，并从原材料、加工各阶段以及产品储存过程中收集了120个样品。加工过程中细菌总数介于<1.0至10.1 ± < 0.1 Log10 CFU/g之间，而中温孢子数量介于<1.0至2.5 ± 0.7 Log10 CFU/g之间。嗜热菌和宽氏芽孢杆菌的孢子数量均低于检测限（1.0 Log10 CFU/g）。选择性富集实验表明，在两种产品的所有加工步骤中均存在宽氏芽孢杆菌。共从原料、加工步骤和成品中分离出127株菌株，这些菌株被归类为系统发育 Group II、III、IV 和 VII，其中 Group IV 菌株最为常见。部分菌株在整个加工过程中持续存在，表明它们对工艺处理具有抗性。约60%的菌株携带 hbl–nhe–cytK 肠毒素基因组合，而引起呕吐的 ces 基因仅检测到一次。在非发酵型甜品中，当储存温度达到10°C时，20天后观察到宽氏芽孢杆菌生长；而在发酵型产品中未检测到其生长。这些发现为污染途径和宽氏芽孢杆菌在加工过程中的持续性提供了见解，有助于设计更安全的植物性乳制品替代品的加工条件。

**引言**
在全球变化和饮食转型的背景下，农业食品产业正在不断丰富其产品种类。越来越多的人出于经济、健康和环境原因调整自己的饮食结构。这一转变的一个主要结果是动物蛋白的消费量减少，取而代之的是被认为更可持续和更健康的植物蛋白来源（Springmann 2024）。2022年至2024年间，法国植物性食品零售市场销量增长了9.9%，2024年销量达到2.32亿件（GFI Europe, 2025）。豆类（如豌豆、蚕豆、大豆和扁豆）因其高蛋白质含量、良好的营养价值以及农业环境效益（如固氮作用和提高土壤肥力）而受到青睐（Gallardo-Guerrero et al., 2025）。豆类越来越多地被用于创新产品的开发，特别是在肉类类似物和乳制品替代品的研发中（Salord et al., 2024）。

除了影响感官质量（如口味、质地和外观）的技术挑战外，微生物安全性对植物性食品替代品来说同样重要，对许多加工食品也是如此。产孢细菌（主要属于芽孢杆菌属和梭菌属）长期以来一直被认为是乳制品、熟食和植物来源成分中的重要污染物。它们在环境中普遍存在，可通过多种途径（包括土壤、灰尘、水和动物）在作物生长的不同阶段污染植物原材料（Carlin 2011）。其产孢能力使它们能够在包括高温、干燥、极端pH值和抗菌剂作用下等恶劣条件下存活（Wells-Bennik et al., 2016）。因此，孢子可能在整个加工过程中持续存在，并能够耐受各种处理工艺。此外，某些加工步骤可能会选择性地消除更敏感的微生物，从而使产孢菌株得以存活甚至占据主导地位。在食品基质中，孢子可能遇到适宜的萌发条件，特别是在蛋白质粉末重新水化或成品储存期间。高水平的营养体生长可能导致产品变质，造成经济损失；如果是致病菌，还可能因在食品中或摄入后产生毒素而对消费者健康构成威胁（Eijlander et al., 2011）。

在产孢细菌中，宽氏芽孢杆菌是一个主要的食品安全隐患。这一分类群具有广泛的遗传和表型多样性，分为 I 至 VII 七个主要的系统发育组，各组在生长温度范围、孢子耐热性和与食源性疾病爆发的关联上存在差异（Guinebretière et al., 2008 & 2025）。根据毒素基因谱型不同，宽氏芽孢杆菌菌株可引发呕吐或腹泻症状：携带 ces 基因簇的菌株可在食品中产生耐热的呕吐毒素 cereulide；而携带 hbl、nhe 和 cytK 等肠毒素基因的菌株可在肠道中生长后产生腹泻毒素（Granum and Lund 2006）。2019年，宽氏芽孢杆菌是欧盟食源性疾病暴发的主要致病菌之一，与金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌并列（EFSA, 2021）。2022年法国报告了1,924起集体食物中毒事件，但只有376例确认了病原体为宽氏芽孢杆菌（Santé publique France, 2024）。除了致病潜力外，宽氏芽孢杆菌还因其能够附着在加工表面并形成难以通过常规清洁和消毒方法去除的生物膜而带来工业风险（Galié et al., 2018）。

关于植物蛋白成分的微生物组成仍有很多未知之处，因为相关的微生物群落高度多变，受多种因素影响（包括植物种类、地理位置、气候、生长和收获条件等）（Chartrel et al., 2021; Simonin et al., 2022）。近期研究指出，宽氏芽孢杆菌是植物蛋白成分中的重要污染物，尤其是在乳制品替代品中（Kyrylenko et al., 2023; Gleissle et al., 2025）。在产品制造过程中重新水化植物蛋白粉末（面粉、蛋白质分离物或浓缩物）会促使孢子萌发并在食品基质中生长。无论是在饮料、发酵产品还是肉类类似物中，都发现了宽氏芽孢杆菌污染（Hai et al., 2023; Kabisch et al., 2024; Roch et al., 2024）。此外，从蔬菜汉堡中也分离出了引起腹泻的宽氏芽孢杆菌菌株（Barmettler et al., 2025）。宽氏芽孢杆菌可以在植物性饮料中存活、繁殖并产生肠毒素，但其导致的变质迹象（如pH值变化和异味）可能未被消费者察觉（Kain et al., 2024）。越来越多的研究致力于预测、评估植物性肉类和乳制品替代品的潜在微生物风险（Ellouze et al., 2021; Buss Da Silva et al., 2022; Misiou et al., 2023; Kain et al., 2024; Champidou et al., 2025）。这些研究结果强调了严格评估与植物性替代品相关的微生物风险的必要性，特别是针对产孢细菌。深入了解这些微生物的来源、多样性和在整个生产链中的行为对于改进工业实践、提升微生物食品安全管理以及最终确保植物性食品的安全性和质量至关重要。

我们假设宽氏芽孢杆菌在植物性甜品中的出现和持续性受到原料微生物质量和所采用加工策略的双重影响，发酵过程可以有效阻止其生长和持续存在。本研究旨在通过追踪从原料到最终产品的污染过程，以及表征这些宽氏芽孢杆菌污染的基因型和致病潜力，来探究配方中的成分和热处理对豌豆蛋白基甜品加工过程中宽氏芽孢杆菌出现、持续性和类型的影响。为此，在一个试点规模下监测了两种植物性甜品的整个加工过程——一种非发酵型甜品（NFD；类似布丁的甜品）和一种发酵型甜品（FD；类似酸奶的甜品），重点关注产孢细菌，尤其是宽氏芽孢杆菌。

**数据处理与分析**
本研究对两种基于豌豆蛋白的甜品替代品进行了三次独立试点规模的生产分析：一种非发酵型甜品（NFD）和一种发酵型甜品（FD）。NFD 和 FD 都含有豌豆蛋白分离物、油籽酱、淀粉和糖；FD 还添加了植物脂肪，而 NFD 中额外添加了另一种豆类面粉。NFD 的主要加工步骤包括混合、均质化、在130°C下加热30秒，最后进行灌装和包装。

**加工过程中细菌总数和产孢细菌的变化**
在原料混合阶段，两种产品的细菌总数有所不同：NFD 的细菌总数介于 4.0 Log10 CFU/g 至 9.5 Log10 CFU/g 之间（图2A），FD 介于 4.5 Log10 CFU/g 至 9.1 Log10 CFU/g 之间（图2B）。正如预期的那样，热处理后细菌总数下降：NFD 在调理前的细菌总数为 6.4 Log10 CFU/g，下降至低于检测限；FD 在发酵前的细菌总数为 2.9 Log10 CFU/g，也下降至低于检测限。

**讨论**
本研究首次结合了产孢细菌的计数和检测方法，跟踪了从原料到最终产品的整个加工过程中的微生物污染情况，并对从中分离出的宽氏芽孢杆菌菌株进行了表征。研究结果支持我们的假设：宽氏芽孢杆菌在植物性甜品中的出现和持续性受到原料微生物质量和加工策略的显著影响。某些高脂肪成分可能因其脂肪含量而增强宽氏芽孢杆菌的存活和持续性。热处理有效降低了产孢细菌和宽氏芽孢杆菌的污染水平。

**作者贡献声明**
Isabelle Souchon：撰写、审阅与编辑、监督、概念构思
Véronique Broussolle：撰写、审阅与编辑、监督、项目管理、概念构思
Marine Zanetti：撰写、初稿撰写、可视化、验证、方法学设计、研究及概念构思
Marie-Helene Guinebretière：撰写、审阅与编辑、监督、方法学设计
Stéphanie Oriol：研究
Fanny Canon：撰写、审阅与编辑

**参考文献**
欧洲食品安全局（European Food Safety Authority）、欧洲疾病预防与控制中心（European Centre for Disease Prevention and Control），2021；法国公共卫生部门（Santé publique France），2024

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

**数据可用性**
数据可根据请求提供。

**资助**
本研究是 M.Z. 博士论文的一部分，得到了 AlinOVeg 项目“创新植物性食品”的支持，该项目由法国政府通过“France 2030”和“Bpifrance”计划资助，并得到了欧盟“下一代欧盟”（Next Generation EU）作为“France Relance”计划的一部分的财政支持。

**致谢**
作者感谢参与试点规模产品开发的 EURIAL 团队，同时对 Alinoveg 联盟提供的宝贵反馈、讨论和对手稿的审阅表示感谢。特别感谢 Rebecca Stevens 博士对手稿的精心校对。

**作者名单**
Marine Zanetti | Marie-Hélène Guinebretière | Stéphanie Oriol | Fanny Canon | Isabelle Souchon | Véronique Broussolle
INRAE，阿维尼翁大学，UMR SQPOV，F-84000 阿维尼翁，法国