动态发酵过程中没食子酸与肌原纤维蛋白的相互作用：结构重塑、氧化调控及分子机制

《Food Bioscience》：Interaction between Gallic Acid and Myofibrillar Proteins during Dynamic Fermentation: Structural Remodeling, Oxidative Regulation, and Molecular Mechanisms

　　

摘要

了解肌原纤维蛋白（MP）在发酵过程中的结构变化对于提高发酵肉制品的质量和稳定性至关重要。然而，发酵温度和没食子酸（GA）对 MP 结构变化的联合作用仍不清楚。本研究利用 Latilactobacillus sakei（希瓦乳杆菌）和 Staphylococcus xylosus（木糖葡萄球菌）建立了一个 MP 发酵模型来模拟肉类发酵。研究了温度（25 °C 和 35 °C）和 GA（0、5、25、125 μmol/g 蛋白）在 72 小时发酵过程中对 MP 结构变化的影响。发酵使 pH 值降至约 4.0，导致蛋白展开、疏水基团暴露和聚集。与 25 °C 相比，35 °C 发酵加速了酸化，D₅₀ 的增加更大，72 小时时达到初始值的约 1.7–2.0 倍，而 25 °C 时为 1.4–1.6 倍。尽管 MP–GA125 显示出最强的 ABTS 自由基清除活性，但 MP–GA25 表现出更好的结构保护，包括更高的巯基保留率、较低的表观表面疏水性以及更稳定的 MHC（约 220 kDa）和肌动蛋白（约 43 kDa）条带。分子对接进一步表明，GA 主要通过氢键和疏水相互作用与 MP 相互作用。总体而言，35 °C 发酵提高了酸化效率，但加速了 MP 的结构劣化，而 25 μmol/g_蛋白的 GA 则减轻了酸化引起的 MP 结构变化。

引言

发酵香肠是一种传统肉制品，由牲畜或禽类的肉和脂肪制成，添加盐、糖、发酵剂、防腐剂和香料，并通过发酵、干燥和成熟加工来形成特征风味、质地和储存稳定性。根据发酵温度、酸化和成熟期的不同，发酵香肠通常分为半干产品和干发酵产品。半干发酵香肠，如夏香肠和黎巴嫩波伦亚香肠，通常在相对较高温度下生产，酸化快，加工周期短。相比之下，干发酵香肠，包括萨拉米香肠，通常在较低温度下经过较长的时间成熟。然而，上述所有产品的安全性和储存稳定性都依赖于多种防腐屏障，包括 pH 值、水分活度（a_W）、盐含量、竞争性微生物和氧化还原环境。在这些因素中，乳酸菌（LAB）通过碳水化合物代谢产生的有机酸以及由此引起的肉类酸化，代表了香肠发酵过程中的一个关键步骤（Sallan 等，2023；Stollewerk 等，2011）。它们的风味和结构发展更强烈地依赖于蛋白水解、脂质氧化和微生物代谢的联合作用（Barbuti & Parolari, 2002; Fan 等，2025）。先前的研究表明，发酵温度显着塑造了干发酵香肠中的细菌演替、风味发展和蛋白降解（Fan 等，2025）。在发酵和成熟期间，肌原纤维蛋白（MP），作为负责肉制品质地形成能力的主要结构蛋白，经历了一系列复杂的变化，包括构象展开、巯基（–SH）暴露、氧化交联、聚集、重排和有限的降解（Li 等，2023；Wang 等，2022）。MP 的适度结构重塑有助于发酵过程中蛋白网络的形成和质量发展，而过度的构象破坏和不可逆聚集可能会损害蛋白结构稳定性并影响后续的功能性能。

香料及其植物提取物长期以来一直被用于发酵肉加工。除了赋予特征香气和风味外，它们还含有生物活性化合物，如酚酸、黄酮类和萜类，这些化合物可能有助于发酵肉制品中的抗氧化保护和品质调节。植物多酚可以通过清除自由基、螯合金属离子和抑制脂质和蛋白氧化来延缓肉制品的质量劣化，因此被视为替代或减少合成抗氧化剂的重要天然功能成分（Hadidi 等，2022；Shah 等，2014）。在发酵香肠中，据报道玫瑰多酚能抑制脂质氧化和生物胺的形成，同时选择性地影响 LAB 生长和微生物多样性。这些发现表明，植物多酚不仅在发酵肉制品中作为抗氧化剂发挥作用，还可能参与调节发酵过程中的品质变化（Zhang 等，2017）。除了抗氧化作用外，多酚还可以通过氢键、疏水相互作用、静电作用以及在某些条件下通过共价反应与 MP 相互作用，从而改变蛋白构象、–SH 氧化、聚集行为和凝胶网络形成（Guo 等，2024；Sun 等，2022）。没食子酸（GA）是一种代表性的酚酸，表现出强烈的自由基清除活性和蛋白结合能力。其羧基和多个酚羟基使其能够与蛋白分子进行多点相互作用。先前的研究表明，GA 可以通过抗氧化和促氧化途径调节 MP 凝胶化和消化特性，其效应强烈依赖于剂量和氧化条件（Cao 等，2016）。此外，GA 可能在氧化或酸性条件下参与 MP 修饰和聚集体形成，这表明其对蛋白结构的调节并不简单地随浓度增加而增加。相反，它很可能涉及多种并发机制，包括抗氧化保护、蛋白结合、–SH 反应以及蛋白 - 多酚复合物聚集（Chen 等，2020；Guo & Xiong, 2019）。

目前，关于蛋白 - 多酚相互作用的研究主要集中在中性或接近生理 pH 条件下的食品蛋白体系上。在这些体系中，蛋白结构相对稳定，蛋白 - 多酚相互作用主要受非共价力支配。然而，在发酵肉中，pH 值并不保持恒定，而是随着 LAB 代谢碳水化合物而逐渐降低。在这个动态酸化过程中，MP 持续经历构象松弛、反应性基团暴露、氧化和聚集。大多数关于酸性条件下 MP 变化的研究都依赖于无机酸或缓冲体系将 pH 调整至固定水平。虽然这种策略可以更好地控制实验变量，但它无法完全重现发酵过程中乳酸的渐进积累、pH 值的动态下降以及连续影响肉类蛋白结构的微生物代谢。最近，人们越来越关注模拟发酵条件下 MP 氧化、水解和功能特性的变化（Yu 等，2020）。尽管如此，对 LAB 驱动的动态发酵过程中蛋白结构的系统表征仍然有限。更重要的是，目前仍不清楚多酚浓度如何在不同酸化速率下调节 MP 的构象展开、氧化交联以及聚集 - 重排。阐明这一问题可能为多酚在调节发酵肉加工过程中蛋白结构演化中的作用提供机制见解。

因此，本研究建立了一个 LAB 驱动的 MP 动态发酵模型。它被用于模拟低盐半干发酵香肠中的渐进酸化过程。在固定盐浓度、接种量和葡萄糖含量的条件下，选择发酵温度和 GA 添加量作为主要实验变量。发酵在 25 °C 和 35 °C 下进行，分别代表相对温和的酸化和快速酸化。GA 添加量为 0、5、25 和 125 μmol/g_蛋白。通过比较不同发酵体系中的 pH 值、平均粒径（D₅₀）及其他结构变化，本研究旨在阐明发酵温度和 GA 浓度如何共同影响 MP 的结构演化。研究结果有望为优化发酵条件、调节蛋白结构以及在发酵肉制品中应用天然多酚提供机制基础。

章节摘要

材料

猪里脊肉购自山姆会员商店（无锡，中国）。本研究使用的发酵剂是 Bactoferm? SM–181，一种从 Chr. Hansen（霍希勒姆，丹麦）获得的商业混合发酵剂，现隶属于诺维信。该发酵剂主要由 Latilactobacillus sakei（原 Lactobacillus sakei, L. sakei）和 Staphylococcus xylosus（S. xylosus）组成。30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液购自上海生工生物工程技术服务有限公司（上海，中国）。其他所有化学品

pH 值

在发酵期间，所有处理组的 pH 值均显著下降，表明在所有实验条件下均发生了活跃的微生物发酵。与 25 °C 的发酵过程相比，35 °C 发酵初期的 pH 值下降更快，这表明较高的温度促进了微生物代谢和有机酸的产生。这与先前的发现一致，即较高的发酵

结论

发酵温度和 GA 添加显着影响了发酵过程中 MP 的酸化行为、结构展开、氧化相关变化、聚集以及蛋白 - 多酚相互作用。35 °C 发酵加速了早期的酸化并促进了蛋白结构的重排，这反映在粒径增长更大、疏水性暴露增强以及二级结构变化更明显上。相比之下，GA 的添加减轻了过度的结构

CRediT 作者贡献声明

Geunpyo Hong： 撰写 – 审阅与编辑，调查。Huanhuan Kuai： 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，调查，形式分析，数据管理。Jiang Jiang： 验证，监督，资源，概念化。Zhendong Liu： 监督，资源

未引用参考文献

Liu 等，2025。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

生成式人工智能和人工智能辅助技术声明

在本工作准备过程中，作者使用了 ChatGPT 来提高语言的清晰度和可读性。作者已审阅和编辑了内容，并对出版物的内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到 内蒙古草原新和生物技术有限公司 和 2022 年国家农业科技园区重点项目（项目编号：NMKJXM202210-2）的资助。

Huanhuan Kuai|Geunpyo Hong|Zhendong Liu|Jiang Jiang

江南大学食品科学与工程学院，江苏无锡，214122，中国