综述：Komagataella phaffii（毕赤酵母）重组蛋白高效生产系统优化：菌株工程、发酵优化与人工智能驱动技术的研究进展

《Engineering Microbiology》：Systematic Optimization of Komagataella phaffii (Pichia pastoris) for High-Efficiency Recombinant Protein Production: Advancements in Strain Engineering, Fermentation Optimization, and AI-Driven Technologies

　　

Komagataella phaffii（原名Pichia pastoris）凭借其公认安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）地位、高效的蛋白分泌能力、真核翻译后修饰系统以及高细胞密度发酵特性，已成为工业酶、食品蛋白和治疗性蛋白生产中不可或缺的真核表达宿主。近年来，遗传工程工具的发展、对K. phaffii蛋白合成与分泌途径认识的深入，以及系统化重组蛋白表达增强策略的开发，进一步确立了该酵母作为一种高效真核表达系统的地位。本综述总结了K. phaffii重组菌株工程中表达盒组件（包括启动子、信号肽和终止子）的设计与筛选进展，并全面概述了影响蛋白合成与分泌的关键分子过程，包括转录、翻译、转位、折叠、翻译后修饰、内质网稳态和囊泡运输，以及相应的增强表达性能的工程策略。在此基础上，研究人员讨论了高细胞密度发酵的优化策略。本综述重点介绍了新兴人工智能（artificial intelligence，AI）驱动技术在K. phaffii表达系统优化中的最新进展，包括基于AI的蛋白序列设计与表达预测、发酵过程的智能控制，以及基因组规模代谢模型引导的菌株工程。最后，讨论了K. phaffii表达系统当前面临的挑战和未来展望。总体而言，本综述系统总结了K. phaffii重组蛋白表达的优化策略及其潜在机制，旨在为研究人员提供全面参考，并加速高效酵母细胞工厂在可持续制造和先进生物工艺产业中的部署。

1. 1.
   引言

受工业、医疗、食品制造和农业应用不断扩大的驱动，全球对多样化、高性能生物活性蛋白（如工业酶、抗体、食品蛋白和抗菌肽）的需求持续增长。开发多功能且经济高效的重组蛋白生产平台对于可持续和绿色制造至关重要。K. phaffii已被证明是一种高效、可持续且经济优势显著的异源蛋白表达宿主。过去三十年来，众多高校和科研机构采用K. phaffii作为重组蛋白生产平台，已有大量异源蛋白在该系统中成功表达，克服了多种表达瓶颈。与大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等工程宿主相比，K. phaffii具有若干显著优势：其拥有强甲醇诱导型内源启动子P_AOX1，能以甲醇为唯一碳源，为高蛋白表达提供了坚实基础；其重组菌株构建的遗传工程体系成熟、操作相对简便，且兼容高细胞密度发酵；作为真核宿主，能对异源表达蛋白进行翻译后修饰；此外，其分泌能力有利于下游纯化。K. phaffii已被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为公认安全（GRAS）微生物，表明其可用于食品相关应用，在食品和制药行业具有巨大潜力。目前已有超过6000种重组蛋白在K. phaffii中成功表达，部分蛋白产量已超过20 g/L。

1. 2.
   菌株构建与表达盒设计的进展

经过数十年研究，K. phaffii重组蛋白表达菌株的构建方法已日趋成熟，相关菌株和质粒已开发为商业产品并广泛使用，其中Invitrogen（美国）的产品最为知名。菌株构建过程中，质粒内的表达盒组件——启动子、信号肽和终止子——构成重组蛋白分泌表达的基础，这些元件具有不同特性，不同组合可导致表达性能的显著差异。

2.1 质粒与菌株

常用的K. phaffii菌株构建质粒包括pPIC3.5K和pPIC9K（含卡那霉素抗性标记和组织酸营养缺陷互补标记），以及pPICZαA和pPICZαB（携带博来霉素抗性基因）。Zhao等人通过片段替换和添加克隆位点设计了改良质粒pPICHKA，减小了质粒尺寸并引入更多克隆位点，便于分子克隆。Li等人基于Cre/loxP系统开发了可回收抗性质粒，质粒整合后可诱导切除筛选标记，克服了抗生素标记一次性使用的限制，支持多拷贝菌株构建和多基因共导入。上述质粒通常需要线性化后才能通过同源重组整合到K. phaffii基因组中，确保目标基因的稳定遗传。Nakamura等人利用K. phaffii自主复制序列Cen2构建了附加型质粒，该载体可在宿主细胞中独立复制，无需预先线性化，从而保持基因组完整性。与早期自主复制元件PARS1和panARS相比，Cen2具有更高的稳定性和更低的质粒丢失率。

目前大多数用于重组蛋白表达的K. phaffii亲本菌株源自原始菌株。最常用的菌株包括：X-33（野生型，兼容携带博来霉素抗性标记的质粒）、GS115（组氨酸营养缺陷型，兼容HIS4互补载体）、SMD1168（敲除内源蛋白酶，更适合表达易降解蛋白）和KM71（甲醇慢利用型菌株）。

2.2 启动子

启动子是启动基因表达所必需的元件。K. phaffii内源醇氧化酶1启动子P_AOX1的转录活性显著高于许多其他天然启动子，因而被广泛使用。P_AOX1受甲醇诱导，并被葡萄糖和甘油等其他碳源抑制。其活性受多种转录因子调控：激活因子Mit1p、Prm1p和Mxr1p增强P_AOX1活性，而抑制因子Nrg1p、Mig1p和Mig2p则抑制其转录输出。

启动子工程是提高基因表达的有效策略。Hartner等人构建了P_AOX1缺失突变体文库，鉴定了显著影响启动子活性的关键区域。Li等人在此基础上通过删除?777至?712区域并重复?203至?190片段，生成了P_AOX1变体，该工程启动子驱动植酸酶表达显著高于野生型P_AOX1。Huang等人通过在其原始位置重新引入预测的转录因子结合基序，工程化了另一个内源启动子P_CAT1，所得P_CAT1-P10变体在脂肪酶CALB和绿色荧光蛋白分泌方面均显著优于野生型P_CAT1和P_AOX1。

组成型启动子P_GAP是K. phaffii中另一个常用的天然启动子，但其活性通常低于P_AOX1，主要用于以甘油和葡萄糖等非甲醇碳源的发酵。通过易错PCR生成的P_GAP突变体文库鉴定出一个变体，使绿色荧光蛋白表达较野生型P_GAP提高19.6倍。Liang等人在K. phaffii基因组中鉴定了另一个启动子P_GCW14，其重组蛋白表达能力显著高于P_GAP。Zhang等人进一步表征了影响P_GCW14活性的关键区域，构建了突变变体P_GCW14-M+20，该工程启动子使南极假丝酵母脂肪酶B的表达较野生型P_GCW14提高33%。这些组成型启动子不依赖甲醇，发酵过程中通常利用甘油和葡萄糖等安全碳源，适合食品级和治疗性蛋白的生产。

2.3 信号肽

K. phaffii将重组蛋白分泌至胞外培养基的能力极大地简化了工业应用中的下游纯化。分泌蛋白需要信号肽引导，K. phaffii表达系统中应用最广泛且最成熟的信号肽是酿酒酵母α-因子信号肽。α-因子信号肽对应酿酒酵母α细胞分泌的交配信息素——交配因子1（mating factor 1，MF1）的N端前导序列，由86个氨基酸组成，其中1–19位残基构成前序列，20–86位残基构成原序列。由酿酒酵母α-因子前导序列引导的重组蛋白分泌经历标准的翻译后转位、内质网（endoplasmic reticulum，ER）到高尔基体的囊泡运输，以及Kex2p和Ste13p蛋白酶的依次蛋白水解加工。

常用的α-因子信号肽通常包含两个突变位点（L42S和D83E），源自Invitrogen开发的商业质粒。与野生型序列相比，该工程版本表现出增强的分泌效率，并含有一个XhoI限制性酶切位点。Aza等人将A9D和A20T突变引入α-因子信号肽，观察到多种酶在酵母中的分泌显著增强。Ito等人报道α-因子信号肽的V50A变体提高了K. phaffii中抗溶菌酶scFv抗体的分泌。Chahal等人基于Jpred二级结构预测和三维建模，设计了α-因子信号肽前序列内的缺失和重复变体，结构修饰增强了辣根过氧化物酶和脂肪酶的分泌。Ahn等人通过α-因子信号肽的同义密码子优化，在不改变氨基酸序列的情况下增强了重组蛋白表达。Barrero等人通过将α-因子信号肽的前序列替换为酿酒酵母Ost1信号序列，生成了杂合前导序列，该工程构建体使脂肪酶BTL2的表达水平较天然对应物提高10倍。Duan等人在K. phaffii中鉴定了多个内源信号肽，证明Mbs2和Dan4等天然信号肽在多种重组蛋白上可优于α-因子信号肽。Shen等人通过K. phaffii分泌组和转录组的多组学挖掘，鉴定了源自PAS-chr3-0030基因的新型内源信号肽，该元件在重组酶生产中表现出优于传统α-因子信号肽的分泌效率。

2.4 终止子

转录终止高度复杂，涉及多种因子的协同作用。终止子位于目标基因3′端，其功能是终止转录，也称为终止序列。AOX1终止子源自K. phaffii内源AOX1基因，在蛋白表达系统中被广泛使用，但对其工程改造或替代性更优终止子的研究仍然有限。终止子序列通过调控转录终止效率进而影响蛋白表达，终止子定义的3′非翻译区（untranslated region，UTR）在决定mRNA半衰期中发挥重要作用，mRNA稳定性增加可提高整体表达水平。

Ito等人在大规模终止调控元件筛选中评估了72个源自K. phaffii和酿酒酵母的终止子对EGFP表达的影响，内源AOX1终止子始终是表现最优的候选之一。Ramakrishnan等人研究发现，酿酒酵母DHAS（磷酸二羟丙酮合酶）终止子在CALB脂肪酶生产中优于传统AOX1终止子。Vogl等人意外鉴定了一个在PCR扩增过程中产生的AOX1终止子突变体，含有NotI位点，该终止子使报告基因表达较野生型AOX1终止子提高37%。Xu等人将AOX1终止子替换为共翻译转位蛋白PMP1p和PMP2p的终止子，并结合信号肽替换为Ost1-proα的策略，显著提高了重组人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和真菌α-淀粉酶的表达水平。Curran等人通过修改效率元件长度、调整GC含量和引入回文序列，重新设计了一系列高效合成终止子。总体而言，与启动子和信号肽相比，K. phaffii高效终止子工具开发和调控机制阐明方面的报道相对较少。

2.5 增加基因剂量

在确定目标蛋白的最佳表达盒后，可通过构建多拷贝菌株来增加基因剂量，从而提高转录输出并提供更多翻译用mRNA模板。多拷贝构建的常见策略包括体外组装法、抗生素梯度筛选、2A序列法以及CRISPR和Cre/loxP方法。此外，整合到核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA）非转录间隔区（non-transcribed intergenic spacer，NTS）代表了一种构建多拷贝菌株的新策略。酵母基因组中的rDNA阵列包含多个重复NTS单元，通过将表达盒两侧翼接rDNA-NTS同源序列，可在rDNA位点同时发生多次整合事件，大幅提高多拷贝菌株的生成效率。这种基于NTS的整合方法赋予所得多拷贝菌株比上述体外组装和抗生素梯度筛选方法更高的稳定性。

1. 3.
   重组蛋白合成与分泌途径

K. phaffii中重组蛋白的合成和分泌涉及多个相互关联的过程，包括转录、翻译、折叠、翻译后修饰、内质网稳态和囊泡运输，这些过程涉及近1000个基因，构成具有广泛反馈调节的高度复杂代谢网络。

3.1 转录

转录是基因表达的第一步。K. phaffii中醇氧化酶基因AOX1和AOX2对甲醇利用至关重要，其中AOX1的表达显著高于AOX2。在非生长限制条件下，AOX1和AOX2被葡萄糖、甘油和乙醇等碳源强烈抑制。然而在甲醇诱导条件下，AOX1 mRNA约占细胞总mRNA的5%，AOX1基因编码的蛋白可占细胞总蛋白含量的30%。P_AOX1的转录激活主要受Mit1、Prm1和Mxr1调控。甲醇信号首先传递至Prm1p，通过自激活快速增加其表达，Prm1p随后激活Mit1的强表达，Mxr1的表达也受甲醇诱导。最终Mit1、Prm1和Mxr1直接结合P_AOX1内的不同位点，共同激活其转录。在葡萄糖或甘油等抑制性碳源存在下，Mig1、Mig2和Nrg1等转录抑制因子抑制P_AOX1活性。Nrg1p直接结合P_AOX1并与Prm1p和Mxr1p竞争结合位点，而Mig1p和Mig2p不直接结合P_AOX1，而是靶向MIT1启动子，间接抑制P_AOX1活性。

基于P_AOX1的调控机制，研究人员开发了具有增强转录输出的工程菌株。Poodeh等人过表达Mit1，观察到K. phaffii中eGFP表达显著增加。Bachleitner等人共过表达Mit1和Mxr1，使异源乳酸脱氢酶表达大幅提高。Shi等人通过同时敲除转录抑制因子并过表达激活因子Mit1p，成功获得不依赖甲醇的表型，即使利用甘油或葡萄糖等替代碳源也能产生可检测水平的AOX1蛋白。Zhu等人通过将细菌DNA结合蛋白与转录激活结构域融合，并在AOX1核心启动子上游整合相应结合序列，构建了转录信号放大装置，不仅允许甘油激活P_AOX1，还使重组蛋白产量较传统甲醇诱导系统提高约5倍。

3.2 翻译

翻译起始是异源蛋白合成中的关键限速步骤，高度依赖43S前起始复合物（43S pre-initiation complex，43S PIC）的组装以及由eIF4F（包含eIF4E、eIF4G和eIF4A）和Pab1介导的mRNA闭环构象形成。Staudacher等人过表达43S PIC组分eIF2和eIF3，但单独或组合过表达均未提高二价纳米抗体vHH的产量。相反，过表达闭环相关因子（eIF4E、eIF4A和eIF4G）和Pab1p显著增强了vHH表达，组合过表达使vHH产量提高2.5倍，该策略应用于HSA也使表达提高约2倍。Huang等人证明过表达eIF4E或eIF4G均可提高K. phaffii中patatin的产量。Liu等人进一步证明过表达eIF4A、eIF4E、eIF4G和Pab1p等翻译因子可分别增强K. phaffii中木聚糖酶的产量。

3.3 新生多肽转位

在分泌表达过程中，新生多肽链由信号肽引导至内质网。真核生物中存在两种不同的转位途径：翻译后转位和共翻译转位。K. phaffii表达系统中主要使用α-因子信号肽，该信号肽介导翻译后转位。多肽先在胞质中完全合成，通过与胞质分子伴侣（主要是Ssa或Ssb家族成员）的相互作用维持未折叠状态。内质网膜上的Sec62/63复合物作为翻译后转位的特异性受体，识别信号肽并将底物递送至Sec61通道，同时释放胞质伴侣。进入Sec61通道后，多肽通过布朗运动转位至内质网腔。腔内Hsp70伴侣BiP（酵母中又称Kar2）被Sec63的J结构域激活，BiP水解ATP并紧密结合新出现的多肽片段，作为棘轮防止多肽链向胞质回滑。

Richard等人通过协同共过表达胞质伴侣和腔内伴侣，构建了“推-拉”模型，同时施加胞质内的“推力”和内质网腔内的“拉力”，有效缓解了转位瓶颈，使抗体片段（Fab和scFv）的分泌提高5倍，在生物反应器发酵中最终滴度超过1.3 g/L。将α-因子信号肽的前序列替换为Ost1信号序列生成的杂合信号肽Ost1(pre)-α-factor(pro)已被证明能显著增强重组蛋白分泌。Besada等人报道该杂合信号肽使细菌内切葡聚糖酶CelA产量提高近2倍，脂肪酶BTL2表达较天然α-因子信号肽提高10倍。Xu等人也证明Ost1(pre)-α-factor(pro)杂合信号肽使真菌淀粉酶、细菌β-葡聚糖酶和HSA的表达水平提高1.3–3.4倍。

3.4 内质网中的蛋白折叠与修饰

进入内质网后，新生多肽必须经过正确折叠和翻译后修饰才能进入下游加工步骤，折叠不当的蛋白倾向于在内质网中聚集。Hsp70家族是最丰富的分子伴侣类别之一，参与多肽转位、折叠和降解的调控。K. phaffii中研究最充分的Hsp70蛋白是Kar2，其结合新生多肽的疏水区域以防止聚集并促进折叠。在Kar2的保护下，蛋白二硫键异构酶PDI1催化相邻半胱氨酸残基之间正确二硫键的形成。在此过程中PDI1被还原而失去活性，内质网氧化还原素1（ERO1）通过接受电子重新氧化PDI1，恢复其催化活性，ERO1最终将电子转移至分子氧，生成过氧化氢，完成氧化还原循环。大量研究表明，单独或组合过表达Kar2、PDI1和ERO1可使K. phaffii中重组蛋白分泌提高2至4倍。

对于含N-糖基化位点的蛋白，新生多肽在内质网中由寡糖转移酶复合物修饰，将预先组装的寡糖（Glc?Man?GlcNAc?）转移到特定基序的天冬酰胺残基上。该聚糖随后被葡萄糖苷酶I、葡萄糖苷酶II和α-1,2-甘露糖苷酶修剪。O-连接糖基化也在内质网中起始，发生在丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上，O-甘露糖基转移酶家族催化甘露糖从磷酸多萜醇转移至多肽。

3.5 内质网稳态

除折叠辅助和糖基化外，内质网在蛋白质量控制和细胞稳态中发挥核心作用。当多肽合成速率增加，进入内质网的蛋白增多，超过可用分子伴侣容量时，错误折叠蛋白积累并聚集，触发内质网应激。为应对该应激，内质网依赖进化上保守的信号网络监测蛋白折叠状态并维持蛋白稳态，这些途径统称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。UPR激活后，首先暂时降低目标蛋白的合成以限制进一步积累；其次促进膜生物发生，导致内质网体积扩张；第三上调分子伴侣和折叠酶的表达以增强折叠能力；第四诱导内质网相关降解（ER-associated degradation，ERAD）途径以清除积累的错误折叠蛋白；最后当稳态无法恢复时，UPR触发程序性细胞死亡。

在酵母中，Ire1作为启动UPR的主要内质网应激传感器。Ire1是内质网跨膜蛋白，含有腔内感应结构域和胞质激酶/内切核糖核酸酶结构域。内质网应激下，腔内结构域直接识别并结合错误折叠蛋白，诱导构象变化促进Ire1二聚化，二聚化使胞质激酶结构域靠近，实现反式自磷酸化并激活RNase结构域。RNase活性的主要底物是编码转录因子Hac1的mRNA。正常条件下Hac1 mRNA含有阻止翻译的内含子，激活的Ire1特异性切除该内含子，使Hac1蛋白得以产生。Hac1随后转位至细胞核，激活多个UPR靶基因的转录，包括KAR2和PDI1等内质网伴侣、ERAD系统组分以及参与磷脂生物合成以扩展内质网膜容量的基因。

在目前提高K. phaffii重组蛋白产量的策略中，过表达Hac1是应用最广泛的方法之一，已有超过40项研究报道该策略提高了重组蛋白产量。ERAD是内质网稳态的核心组成部分，受UPR增强，其主要功能是识别和清除内质网中错误折叠或未组装的蛋白，将其逆转运至胞质，并通过泛素-蛋白酶体系统降解。酵母中存在三种主要ERAD途径：ERAD-L、ERAD-M和ERAD-C，其中ERAD-L介导腔内蛋白的降解，是酵母中分泌蛋白降解的主要途径。在ERAD-L途径中，糖苷酶Mns1和Htm1首先修剪错误折叠蛋白的聚糖链，暴露α-1,6-甘露糖残基，这些修饰后的蛋白被Yos9识别并递送至内质网膜蛋白Hrd3，Hrd3再将底物转移至Hrd1复合物形成的逆转运通道，错误折叠蛋白随后通过Hrd1通道从内质网输出，被Hrd1泛素化并递送至蛋白酶体降解。

虽然ERAD对维持内质网稳态必不可少，但过度的ERAD活性可能持续降解重组目标蛋白，导致产物损失和表达效率降低。Xu等人证明删除Der1可减弱ERAD活性，使β-葡萄糖苷酶产量提高40%而不影响细胞生长。Wang等人报道在培养基中补充氮源可减少ERAD介导的目标蛋白降解，在生物反应器培养中维持铵浓度为300 mM和酪蛋白水解氨基酸为1.0%（w/v）可显著减少产物损失，使脯氨酰内肽酶产量提高1.48倍。

3.6 囊泡运输

在内质网中正确折叠后，分泌蛋白必须运输至高尔基体进行最终折叠和修饰。COPII包被囊泡介导蛋白从内质网到高尔基体的运输。首先，内质网膜蛋白Sec16招募鸟嘌呤核苷酸交换因子Sec12，Sec12激活Sar1使其转化为GTP结合形式，激活的Sar1将N端两亲性螺旋插入内质网出口位点的内膜叶，增加膜曲率并启动COPII组装。随后Sar1-GTP招募Sec23和Sec24形成异二聚体前出芽复合物，Sec24负责货物识别和结合。Sar1-GTP/Sec23/Sec24亚复合物随后招募Sec13和Sec31，形成COPII囊泡的外层笼。囊泡组装完成后，Sec31刺激Sec23的GTPase活性，将Sar1-GTP转化为Sar1-GDP，导致膜亲和力降低、膜解离和囊泡断裂。COPII囊泡随后从内质网出芽并运输至高尔基体。

运输过程中，TRAPPI复合物通过其Bet3亚基与Sec23的相互作用结合COPII囊泡，Ypt1被整合到囊泡膜中。TRAPPI催化Ypt1上GDP与GTP的交换，激活的Ypt1-GTP招募Uso1，Uso1通过其柔性结构将囊泡锚定至高尔基体膜。到达高尔基体后，COPII包被解体，暴露v-SNARE蛋白。囊泡上的v-SNARE蛋白与靶膜上的t-SNARE蛋白在SM蛋白Sly1的辅助下配对，形成反式SNARE复合物，使膜靠近、克服水合排斥力并驱动脂双层融合，货物蛋白最终被递送至高尔基体腔。

在高尔基体成熟后，货物蛋白通过类似但不同于COPII运输的囊泡运输机制被运送至胞外。去包被后，囊泡经历Rab GTPase转换，Ypt31/32首先被激活并招募鸟嘌呤核苷酸交换因子Sec2，Sec2随后激活中心Rab蛋白Sec4，Sec4-GTP直接招募V型肌球蛋白马达蛋白Myo2p，Myo2p沿肌动蛋白电缆将分泌囊泡运输至质膜。在质膜处，囊泡被锚定至外泌复合物。外泌复合物是由Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70和Exo84组成的八聚体复合物。囊泡携带v-SNARE蛋白Snc1p/Snc2p，质膜含有由跨膜蛋白Sso1p/Sso2p和外周膜蛋白Sec9p组成的t-SNARE，SM家族蛋白Sec1促进v-SNARE和t-SNARE复合物的组装，其α螺旋结构域以拉链方式缠绕形成高度稳定的反式SNARE复合物，释放大量自由能，拉动两膜靠近、驱动融合并最终形成融合孔，囊泡腔与胞外环境连通，实现货物蛋白的分泌。

Shi等人报道过表达Sec12使K. phaffii中葡萄糖氧化酶产量提高近30%。Wu等人证明过表达COPII组分Sec23、Sar1和Erv29分别使豆血红蛋白分泌提高48%、28%和39%。Guan等人证明过表达Sec1或Sly1分别使IL2-HSA融合蛋白分泌提高2.5倍和1.9倍。Liu等人发现过表达高尔基体囊泡核心组分Sec4使葡糖淀粉酶产量提高2.5倍。

3.7 高尔基体介导的分泌蛋白修饰

到达高尔基体后，货物蛋白通常已完成基本的三维折叠，高尔基体的主要作用是微调翻译后修饰（主要是糖基化）和质量分选。使用α-因子信号肽系统表达的分泌蛋白需要蛋白水解加工才能成为成熟活性形式。Kex2p是高尔基体定位的膜相关蛋白酶，识别并切割双碱性基序，去除货物蛋白的N端前肽。Sun等人通过过表达Kex2优化高尔基体内N端信号序列的加工效率，显著增强了前导肽切割，随后提高了牛乳铁蛋白的产量。Aggarwal等人发现将α-因子信号肽Kex2切割位点P1′位的Glu替换为Val或Ala可提高切割效率，从而增强K. phaffii中人粒细胞集落刺激因子的表达。

在内质网中，N-糖基化产生Man?GlcNAc?核心寡糖结构。在高尔基体中，经过一系列糖基化事件，最终生成含超过100个甘露糖残基的高度糖基化结构。与N-糖基化类似，O-糖基化也发生在高尔基体中，具有抗蛋白水解保护等重要作用。K. phaffii产生的重组蛋白通常表现出广泛糖基化，与人类和哺乳动物细胞中的糖基化差异显著，可能引发免疫原性反应，因此K. phaffii中的人源化糖基化工程日益受到关注，当前策略包括删除内源糖基化酶和引入人糖基化途径基因。