干旱胁迫与高密度种植互作对大豆花/荚脱落的影响

《Environmental and Experimental Botany》：Interactive effect of drought stress and high planting density on flower/pod abscission of soybean

　　

• 互作胁迫协同增强了大豆花/荚脱落。
• SN12通过上调蔗糖磷酸合酶（SPS）、蔗糖合酶（SUS）和转化酶的表达来维持花器官的碳供应。
• GH3基因的上调降低了活性生长素（IAA）水平，同时SN28中乙烯（ET）/脱落酸（ABA）信号通路被激活。
• 加权基因共表达网络分析（WGCNA）将糖代谢与激素信号模块关联起来，揭示了协同调控脱落的机制。

大豆是重要的粮、油、饲兼用作物，然而花/荚脱落在大豆生产中普遍存在，脱落率可达30%至80%，已成为限制大豆遗传产量潜力实现的主要生理障碍之一。花/荚脱落不仅直接决定单株有效荚数，还影响源库关系与群体干物质积累效率。近年来，气候异常频发叠加集约化种植模式的普及，使田间环境胁迫加剧，花/荚脱落显著加重，严重制约了我国大豆单产提升并加剧了年际间产量波动。高密度种植作为突破产量瓶颈的重要栽培策略，在农业生产中应用日益广泛，然而过度密植加剧了植株间对光、水、养分等资源的竞争，导致群体光合效率下降、养分转运受阻，进而促进花/荚脱落并最终导致产量与品质的显著下降。花器官的碳同化与能量供应状态被认为是决定生殖器官是否脱落的关键因素。已有研究表明，干旱胁迫通过降低气孔导度、诱导叶片细胞脱水和氧化损伤，导致净光合速率（Pn）急剧下降，从源头上切断了碳供应。遮荫与弱光胁迫同样会耗竭碳储备、加剧营养器官与生殖器官之间的竞争，并促进花和果实的败育与脱落。器官脱落的发生最终依赖于离区（AZ）的形成与激活，而这一过程受生长素（IAA）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）和乙烯（ET）等植物激素的协同调控。在遮荫条件下，易感大豆品种花中IAA含量、IAA-氨基酸复合物及ABA含量增加，PIN家族基因下调，GH3家族基因上调，表明生长素极性运输受损和IAA失活可能共同促进花脱落。IAA梯度的改变以及乙烯敏感性的增强是AZ激活的重要机制。随着乙烯信号转导的激活，一系列编码细胞壁降解酶的基因被诱导表达，包括纤维素酶（CE）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）和木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（XTH）等水解酶。尽管已有研究分别探讨了干旱或密植遮光对大豆花/荚脱落的影响，但关于干旱与高密度种植互作胁迫如何协同扰动源组织糖代谢网络并进而调控花/荚脱落的系统机制仍缺乏深入认识。基于上述背景，本研究选用耐密植品种沈农12（SN12）和常规品种沈农豆28（SN28）为试验材料，设置正常对照（CK）、高密度种植（M）、干旱（D）以及干旱与高密度种植互作（MD）4种处理，系统分析了不同胁迫条件下大豆光合生理特性、花器官糖代谢关键代谢物含量及相关酶活性、花柄离区细胞壁降解酶活性等的变化，并结合转录组测序与加权基因共表达网络分析（WGCNA），以期揭示环境-栽培复合胁迫下大豆生殖器官脱落的生理机制，为大豆抗逆调控与高产栽培及分子育种靶点的挖掘提供理论依据。该研究发表于《Environmental and Experimental Botany》。

研究人员采用盆栽试验，以耐密植品种SN12和常规品种SN28为材料，在沈阳农业大学科研试验基地（41.82° N，123.57° E）开展。试验设置品种、种植密度（2株/盆和6株/盆）和水分处理（正常供水：土壤相对含水量为田间持水量的75%-80%；中度干旱：45%-50%）三因素完全随机设计，共8个处理组合，每处理10次生物学重复。干旱胁迫于大豆R1期开始，持续7天。研究人员测定了花/荚脱落率、产量性状、光合参数（净光合速率Pn和蒸腾速率Tr）、叶片渗透调节物质含量、花器官糖代谢相关生理指标（可溶性糖、蔗糖、淀粉含量以及蔗糖磷酸合酶SPS、蔗糖合酶SUS、酸性转化酶AI和中性转化酶NI活性）以及花柄离区脱落相关酶（β-半乳糖苷酶β-Gal、多聚半乳糖醛酸酶PG、果胶甲酯酶PME、纤维素酶CE）活性；采用石蜡切片技术观察花柄离区显微结构；利用Illumina NovaSeq平台进行转录组测序，并结合WGCNA构建基因共表达网络，最后通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证RNA-seq数据的可靠性。

3.1 干旱、高密度种植及其互作胁迫对大豆花/荚脱落率的影响。花数和花/荚脱落率统计分析表明，M、D和MD处理均显著减少两个品种的花数，其中MD处理减少幅度最大，但耐密植品种SN12在复水后表现出明显的补偿性开花。在SN12中，CK脱落率为63.2%，M、D和MD处理分别增至71.7%、64.2%和81.9%，MD较CK增加29.7%；在SN28中，CK脱落率为66.9%，M、D和MD处理分别增至79.3%、75.5%和88.7%，MD较CK增加32.7%。两品种互作胁迫下的脱落率均显著高于其他处理（P<0.05），且不耐密植品种SN28的脱落率高于耐密植品种SN12。三因素方差分析表明，品种、干旱和种植密度对花/荚脱落率均有极显著影响（P<0.01）。

3.2 干旱、高密度种植及其互作胁迫对大豆光合作用的影响。与CK相比，SN12在M、D和MD处理下Pn分别降低17.1%、31.6%和42.7%，SN28分别降低27.9%、29.9%和48.4%；Tr的变化趋势与Pn相似。两品种互作胁迫下Pn和Tr均显著低于其他处理（P<0.05），且SN28的Pn和Tr均低于SN12，表明互作胁迫对不耐密植品种光合系统的损伤更为严重。

3.3 干旱、高密度种植及其互作胁迫对大豆渗透调节物质的影响。在耐密植品种SN12中，MD处理下叶片可溶性糖含量较CK增加25.1%，可溶性蛋白含量增加26.1%；在不耐密植品种SN28中，D处理下可溶性糖含量较CK增加32.12%，而MD处理下可溶性蛋白含量较CK显著降低47.84%。两品种脯氨酸含量均在D处理下最高，MD处理下显著高于CK和M处理。这些结果表明，渗透调节物质的积累模式存在品种间差异，且脯氨酸的大量积累更可能反映胁迫伤害而非有效的保护性响应。

3.4 干旱、高密度种植及其互作胁迫对大豆糖代谢相关生理参数的影响。在SN12花器官中，MD处理下可溶性糖含量较CK增加62.8%（10.65 mg g^-1升至17.34 mg g^-1），SPS、SUS、AI和NI活性均显著升高，蔗糖含量也显著增加；在SN28中，MD处理下可溶性糖含量较CK增加82.0%（11.85 mg g^-1升至21.59 mg g^-1），但SPS等四种酶活性均显著降低。淀粉含量方面，SN12在M、D和MD处理下较CK分别降低49.2%、63.2%和32.5%，SN28在MD下降低75.3%。这些结果表明，耐密植品种通过上调糖代谢酶活性维持花器官碳供应，而不耐密植品种则表现为糖代谢酶活性受抑，出现碳饥饿状态。

3.5 干旱、高密度种植及其互作胁迫对大豆花柄离区脱落相关酶含量及显微结构的影响。MD处理下两品种花柄离区中β-Gal、PG、PME和CE活性均显著高于其他处理（P<0.05），且SN28中这些酶活性整体高于SN12。显微结构观察显示，MD处理下SN12花柄组织严重解体，SN28顶端分生组织分化严重紊乱、细胞排列无序并出现结构断裂，互作胁迫对两品种均产生破坏性叠加效应。

3.6 干旱、高密度种植及其互作胁迫对大豆产量的影响。与CK相比，M、D和MD处理使SN12荚数分别降低13.20%、15.60%和38.40%，SN28分别降低19.65%、13.10%和48.03%；粒数方面，SN12分别降低18.60%、15.80%和30.00%，SN28分别降低30.13%、19.87%和52.30%；粒重方面，SN12分别降低28.04%、18.19%和45.22%，SN28分别降低39.57%、23.87%和60.52%。互作胁迫下两品种百粒重均显著低于其他处理（P<0.05），且SN28降幅更大。

3.7 大豆各生理指标间的相关性分析。Pearson相关分析显示，花/荚脱落率与Pn、Tr、荚数、粒数和粒重呈极显著负相关（P<0.01），与花器官淀粉含量和酸性转化酶活性显著负相关（P<0.05），与β-Gal、PG、PME和CE等细胞壁降解酶活性呈极显著正相关（P<0.01）。

3.8 干旱、高密度种植及其互作胁迫对大豆花转录组的影响。转录组测序共获得148.13 Gb clean data，Q30比例达95.12%以上，与参考基因组的比对率为88.35%-94.77%。DEGs鉴定结果显示，SN28在密植及互作胁迫下的DEGs数量多于SN12。KEGG富集分析表明，耐密植品种SN12在互作胁迫下上调基因显著富集于淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、类黄酮生物合成等通路；SN28中下调基因富集于淀粉和蔗糖代谢、碳代谢、糖酵解/糖异生等通路。在淀粉和蔗糖代谢通路中，SN12中编码SPS、SUS、转化酶和淀粉水解相关酶的基因在互作胁迫下显著上调，而SN28中上述基因多表现为下调。在植物激素信号转导通路中，MD处理下SN12中GH3基因上调促进IAA失活，而SN28中乙烯信号组分ETR、EBF1/2、ERF1/2和ABA信号组分PYR/PYL、PP2C显著上调，表明乙烯和ABA信号在SN28中被激活。WGCNA共鉴定出12个共表达模块，其中MEgreenyellow模块与SPS和SUS活性显著正相关，核心基因包括糖转运蛋白STP10和UDP-葡糖醛酸脱羧酶等，在SN12的密植和互作胁迫处理中高表达；MEgrey60模块与淀粉含量极显著正相关，其基因在SN28各胁迫处理中普遍下调。

在讨论部分，研究人员总结了以下三个方面的调控机制：（1）糖代谢与源库关系对花/荚脱落的调控：互作胁迫下源器官光合产物供应不足与库器官利用能力下降共同导致花器官碳饥饿，SN12通过上调SPS、SUS和转化酶维持花器官碳供应，而SN28表现为代谢受抑；花器官可溶性糖积累可能源于蔗糖水解或利用受阻，呈现“高糖低代谢”状态，因此评价碳状况需结合糖代谢酶活性与糖组分转化进行综合判断。（2）渗透保护物质的差异化响应：叶片可溶性糖积累并非有效的保护性响应，而是库容量受限导致光合产物滞留于源器官的结果，过量糖可能通过反馈抑制进一步降低光合碳同化；脯氨酸的大量积累更可能反映胁迫伤害与氮代谢紊乱。源器官糖积累与花器官糖饥饿并存表明，源库之间光合产物转运受阻是花/荚脱落的关键诱因。（3）植物激素信号转导与脱落相关酶活性的调控：互作胁迫下GH3基因上调促进IAA失活，降低离区活性生长素水平，解除其对脱落的抑制作用；SN28中乙烯和ABA信号组分显著上调，而SN12中相对受抑，表明生长素梯度耗竭与乙烯/ABA信号增强共同启动器官脱落；脱落率与细胞壁降解酶活性的正相关及离区显微结构损伤证实，激素失衡最终通过激活离区水解酶促进脱落。WGCNA揭示了糖代谢模块与激素信号模块间的协同关系，表明碳代谢状态与激素信号在转录水平紧密关联。研究人员同时指出，本研究基于盆栽试验和短期胁迫处理，可能低估田间小气候和根系竞争的复杂性；种植密度仅设置两个水平，无法评估密度胁迫与脱落的剂量-效应关系；转录组分析基于整花而非离区组织，且未进行外源糖或激素补充实验，因此“碳饥饿-激素失衡-脱落激活”模型应视为工作假说。

本研究以耐密植品种SN12和常规品种SN28为试验材料，基于光合生理、碳代谢、细胞壁降解、生物信息学及共表达网络分析等多层次数据，揭示了大豆花/荚脱落对干旱与密植互作胁迫的品种差异响应，并提出了以碳代谢为核心、以激素信号为枢纽的协同调控假说。胁迫最初通过降低净光合速率和蒸腾速率损害源器官同化能力，限制碳同化物的生产与输出，导致花器官可溶性糖、蔗糖和淀粉含量显著下降，造成明显的碳亏缺。同时，SPS、SUS和转化酶活性的变化扰乱了花器官的源库平衡，引发糖饥饿响应。叶片中可溶性糖和脯氨酸的积累并非有效的保护性响应，而更可能反映库容量受限导致的光合产物滞留以及氮代谢紊乱，过量糖还可能对光合作用产生反馈抑制。结构层面，双胁迫下花柄离区组织明显解体，表现为细胞排列松散、细胞壁连续性降低，伴随β-Gal、PG、PME和CE等细胞壁降解酶活性显著增强，表明细胞壁多糖降解加速、离区细胞分离加剧，从而促进离层形成。转录组分析进一步揭示，干旱和密植胁迫通过调节淀粉和蔗糖代谢及植物激素信号转导通路影响花器官碳分配，互作胁迫下两条通路均被显著富集。WGCNA鉴定的MEgreenyellow和MEgrey60模块与糖代谢密切相关，进一步支持了碳代谢失衡在脱落调控中的核心地位。