TaPR1-66作为小麦条锈病抗性的正调控因子

《Environmental and Experimental Botany》：TaPR1-66 Functions as a Positive Regulator of Wheat Stripe Rust Resistance

　　

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici，Pst）引起的真菌性病害，该病原菌为严格专性寄生菌。Pst的夏孢子适应凉爽环境，用于越冬和越夏，常导致春季流行。该病害已在全球多个国家报道，对中国、美国、澳大利亚、印度和英国等主要小麦生产国造成严重影响。小麦条锈病的流行主要归因于新生理小种的出现和持续变异，包括CYR32、CYR33和CYR34。抗病品种的选育被认为是控制条锈病最经济有效的途径。 病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）是一组低分子量抗微生物化合物，在植物防御病原体的机制中发挥关键作用。迄今已鉴定出17个PR家族，广泛分布于小麦中，包括类甜蛋白、几丁质酶、过氧化物酶、葡聚糖酶和蛋白酶等。PR1作为PR家族的成员，具有抗真菌和抗病毒特性，被证明有助于植物抵抗逆境。此外，PR1被用作系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）的标志物，SAR是一种由病害诱导的防御机制。PR1被鉴定为水杨酸（salicylic acid，SA）响应基因，并在SA信号通路中发挥重要作用。在小麦中，外源施用SA可诱导PR1表达。 基于前期研究，研究人员鉴定出一个在小麦-Pst互作过程中显著上调表达的基因。为进一步阐明其生物学功能，研究人员采用病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）进行验证，证明TaPR1-66正调控小麦对条锈病的抗性。此外，通过亚细胞定位分析，TaPR1-66定位于质外体。该研究为先前研究提供了重要补充，旨在推进对小麦条锈病抗性的理解，并促进抗病小麦品种的开发。

一、研究背景与意义

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici，Pst）引起的真菌性病害，该病原菌为严格专性寄生菌，其夏孢子适应凉爽环境，用于越冬和越夏，常导致春季流行。该病害在全球多个国家均有报道，对中国、美国、澳大利亚、印度和英国等主要小麦生产国造成严重影响。小麦条锈病的流行主要归因于新生理小种的出现和持续变异，包括CYR32、CYR33和CYR34。抗病品种的选育被认为是控制条锈病最经济有效的途径。

病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）是一组低分子量抗微生物化合物，在植物防御病原体的机制中发挥关键作用。迄今已鉴定出17个PR家族，广泛分布于小麦中。PR1作为PR家族的成员，具有抗真菌和抗病毒特性，被证明有助于植物抵抗逆境。PR1还被用作系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）的标志物，并被鉴定为水杨酸（salicylic acid，SA）响应基因，在SA信号通路中发挥重要作用。尽管PR1在植物防御中的重要性已被广泛认可，但其在小麦抵抗Pst中的具体作用及潜在分子机制仍有待充分阐明。基于此，研究人员开展本研究，旨在深入解析TaPR1-66在小麦条锈病抗性中的生物学功能。

二、主要技术方法

研究人员以全生育期抗条锈病的新春32号（XC32）小麦品种为研究材料，在明贤169（MX169）上繁殖条锈病。研究采用病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技术，通过大麦条纹花叶病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）介导的基因沉默系统对TaPR1-66进行瞬时敲低，设置BSMV:00（不沉默任何基因）、BSMV:TaPDS（沉默TaPDS基因作为阳性对照）和BSMV:TaPR1-66（沉默靶基因TaPR1-66作为处理组）三种处理。此外，研究人员还利用qRT-PCR分析基因表达模式，通过组织学观察统计吸器母细胞数、菌丝长度、夏孢子堆线性长度和单位面积夏孢子堆数量，采用WGA-Alexa488染色观察条锈菌菌丝，DAB染色检测H?O?积累水平，并在烟草叶片和小麦原生质体中开展亚细胞定位分析。

三、研究结果

3.1 TaPR1序列分析

研究人员对XC32进行转录组测序，鉴定出566个在Pst接种后24、48、120、240和360小时显著上调表达的基因。通过逐一分析和qRT-PCR鉴定出候选基因TraesCS5B03G0483900，在小麦-Pst互作过程中急剧上调表达，根据基因家族鉴定结果将其重新命名为TaPR1-66。从XC32中克隆出TaPR1-66的495 bp开放阅读框（open reading frame，ORF）片段，编码165个氨基酸，含有CAP结构域。

3.2 TaPR1-66基因表达的组织特异性

研究人员从URGI网站下载TaPR1-66及其同源基因的RNA-Seq表达数据进行分析，结果显示TaPR1-66在根和叶中高表达，在茎中几乎检测不到。相比之下，TaPR1-66-5C的表达水平低于TaPR1-66-5A和TaPR1-66-5B。

3.3 Pst诱导的TaPR1-66表达

研究人员采用qRT-PCR检测XC32在Pst诱导后不同时间点TaPR1-66的表达情况。结果表明，TaPR1-66在Pst接种后24小时急剧上调表达，在120小时达到表达峰值。由此推断TaPR1-66基因表达受Pst侵染诱导。

3.4 TaPR1-66正调控小麦对Pst的抗性

重组病毒接种10天后，阳性对照BSMV:TaPDS小麦叶片出现明显光漂白现象，BSMV:00和BSMV:TaPR1-66小麦叶片均出现褪绿。对成功感染重组病毒的小麦第四叶接种Pst，在接种后0、24、48和120小时检测TaPR1-66沉默效率。接种后13至15天观察小麦叶片发病情况，对照组和处理组叶片上均发现夏孢子堆，但BSMV:TaPR1-66接种的小麦叶片上夏孢子堆数量显著高于BSMV:00。BSMV:TaPR1-66植株中TaPR1-66基因表达较BSMV:00植株降低约30%至70%，表明TaPR1-66沉默系统在小麦叶片中成功构建。

3.5 沉默TaPR1-66增强Pst在小麦中的扩展

接种后48小时，BSMV:00和BSMV:TaPR1-66处理的小麦叶片在Pst形态和H?O?积累方面无显著差异。然而在接种后240小时，BSMV:TaPR1-66接种的叶片中检测到菌丝密度和吸器数量增加，夏孢子堆的线性长度和单位面积数量增大，H?O?积累显著减少。这些结果综合表明，沉默TaPR1-66损害了XC32的条锈病抗性。

3.6 TaPR1-66亚细胞定位

研究人员在烟草叶片细胞和小麦原生质体中分别表达eGFP-TaPR1-66和TaPR1-66-GFP融合蛋白，在烟草细胞和小麦原生质体的外周检测到绿色荧光，表明TaPR1-66呈外周分布模式。从表现出绿色荧光的烟草叶片中提取总蛋白，使用GFP抗体进行Western blot分析，结果证实eGFP和eGFP-TaPR1-66蛋白在烟草细胞中成功表达。

四、讨论与结论

讨论部分指出，植物通过激活防御机制应对病原体侵染。水杨酸作为重要信号分子，已被证明广泛参与防御相关蛋白的激活。目前PR1的转录水平已被广泛用作抗病性标志物，在抗赤霉病和壳针孢叶枯病的小麦品系中也检测到PR1转录本的显著积累。然而，此前尚无直接报道表明TaPR1的存在会影响病原体或其动态变化。VIGS技术已广泛应用于植物发育和代谢基因、抗逆基因以及抗病通路中信号转导相关基因的研究。本研究通过VIGS瞬时沉默TaPR1-66，导致小麦叶片中菌丝长度和夏孢子堆面积增加，抗病性受损，揭示TaPR1-66在小麦-Pst互作中作为正调控因子发挥作用。研究结论仅限于XC32品种，TaPR1-66是否在感病品种中赋予类似的抗性功能尚不清楚。本研究采用混合Pst分离物进行功能验证，该基因是否对中国的优势生理小种CYR32、CYR33和CYR34同样有效有待进一步研究。

研究结论部分翻译如下：在本研究中，通过VIGS介导的功能鉴定，TaPR1-66被确定为小麦条锈病抗性的正调控因子。TaPR1-66在Pst侵染后被诱导表达，在抗病小麦品种XC32中瞬时沉默该基因与真菌生长和夏孢子堆发育增加相关。亚细胞定位显示TaPR1-66呈外周分布模式。这些发现为理解PR1基因在小麦抵御Pst中的作用提供了基础。该研究发表在《Environmental and Experimental Botany》期刊上，为挖掘抗性基因和开发新种质资源提供了理论依据，对保障中国小麦生产安全具有直接意义。