警报素pGpp通过GTP耗竭抑制翻译

《Nucleic Acids Research》：The alarmone pGpp inhibits translation through GTP depletion

　　

细菌在应激期间产生警报素核苷酸ppGpp和pppGpp，以影响复制、转录和代谢。ppGpp和pppGpp还通过竞争性结合翻译GTP酶来减弱翻译，从而在应激期间节约资源。最近，pGpp被鉴定为第三种警报素，而诸如艰难梭菌（Clostridioides difficile）等重要病原体在应对应激时仅产生pGpp。尽管pGpp作为警报素含量丰富，但其在介导应激反应中的确切作用仍知之甚少。在此，研究人员表明，虽然pGpp在体外是比ppGpp和pppGpp更弱的蛋白质合成抑制剂，但在模型革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中，pGpp的产生导致体内更快的翻译抑制。与(p)ppGpp产生相比，pGpp产生导致参与翻译的核糖体更少，休眠核糖体二聚体更多，表明翻译起始受到强烈抑制。此外，pGpp产生比(p)ppGpp产生更快地耗竭细胞GTP，研究人员证明这足以抑制翻译。pGpp产生期间更快的GTP耗竭还伴随更强健的转录组重塑。这项工作扩展了警报素通过GTP耗竭抑制翻译的模型，并证明不同警报素种类对生理产生不同影响。

细菌在应激时会产生警报素（alarmone）核苷酸，包括鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），统称为(p)ppGpp。长期以来，(p)ppGpp被认为通过直接结合复制、转录和翻译相关蛋白来调节生理活动；然而在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等多数细菌中，(p)ppGpp并不直接结合RNA聚合酶，因此GTP耗竭被认为是驱动全局转录反应的重要机制。近年来，鸟苷-5′-单磷酸-3′-二磷酸（pGpp）被认定为第三种警报素；一些重要病原体如艰难梭菌（Clostridioides difficile）在应激时只产生pGpp，但pGpp单独能否介导翻译调控尚不清楚。已有研究表明pGpp对翻译GTP酶几乎没有结合亲和力，因此其在体内的抑制作用机制存在疑问。为回答这一问题，研究人员利用遗传诱导手段在枯草芽孢杆菌中分别特异性产生pGpp或(p)ppGpp，从而在不施加氨基酸饥饿等外源应激的情况下比较不同警报素对翻译、GTP水平和转录组的影响。相关论文发表在《Nucleic Acids Research》。

研究人员首先通过体外转录-翻译系统证明pGpp是比ppGpp和pppGpp更弱的蛋白质合成抑制剂；随后在枯草芽孢杆菌168 trpC2背景下构建了pGpp可诱导菌株和(p)ppGpp可诱导菌株，利用木糖诱导SasA合成酶表达，并通过是否存在NahA水解酶来控制积累的警报素种类。主要关键技术包括：遗传诱导警报素合成、体外翻译抑制实验、放射性³²P正交磷酸标记结合薄层色谱（TLC）检测核苷酸、多聚核糖体谱分析、氯化钾（KCl）和嘌呤霉素处理区分解离核糖体、L-高炔丙基甘氨酸（HPG）标记检测总蛋白合成、蛋白质印迹、RNA测序（RNA-seq）和利福平测序（rif-seq）以及体外酶活分析。所有菌株均以枯草芽孢杆菌168 trpC2为背景，并在S7培养基中培养。

（1）(p)ppGpp在体外比pGpp更强地抑制蛋白质合成
研究人员使用PURExpress体外转录-翻译系统，以T7启动子驱动DHFR报告基因表达，加入不同浓度的pGpp、ppGpp和pppGpp。结果显示，三种警报素对DHFR产生的抑制效果存在显著差异；pGpp抑制作用最弱，ppGpp在2.5 mM时几乎完全抑制DHFR产生，而pppGpp在1 mM时已显著抑制。这表明pGpp对翻译GTP酶的低亲和力使其在体外成为较弱的翻译抑制剂。

（2）不依赖饥饿的pGpp和(p)ppGpp产生可在体内快速降低GTP并阻滞生长
在指数期诱导警报素合成后，pGpp和(p)ppGpp可诱导菌株均在40分钟内停止生长。放射性标记核苷酸结合TLC检测发现，诱导10分钟后总GTP下降约50%，总ATP上升约3.4倍；pGpp产生在20分钟和30分钟时比(p)ppGpp产生导致更明显的GTP耗竭（分别下降75%对63%，77%对68%）。在(p)ppGpp诱导菌株中可检测到ppGpp和pppGpp累积，而pGpp诱导菌株中几乎检测不到，说明NahA有效将(p)ppGpp水解为pGpp。

（3）pGpp产生在体内比(p)ppGpp产生更快抑制翻译
HPG标记实验显示，pGpp和(p)ppGpp诱导均快速降低总蛋白合成，但pGpp诱导的抑制速度更快。多聚核糖体谱分析表明，警报素产生后多聚核糖体快速减少，同时HPF结合的100S休眠核糖体二聚体增加；与(p)ppGpp产生相比，pGpp产生导致重多聚核糖体消失更快、休眠核糖体二聚体出现更快，说明pGpp产生在体内能更迅速地抑制翻译。

（4）GTP耗竭足以抑制翻译并诱导核糖体休眠
研究人员使用GuaB/IMPDH抑制剂霉酚酸（MPA）在无警报素产生的(pp)pGpp0背景中使GTP耗竭程度与警报素诱导时相当。MPA处理后多聚核糖体减少，100S休眠核糖体二聚体增加，与警报素产生时的现象一致。在表达催化失活NahA（NahAE49Q,E53Q）的(pp)pGpp0菌株中，MPA处理仍产生类似效果，说明NahA对翻译的影响依赖其警报素水解活性，而GTP耗竭本身足以抑制翻译并促进核糖体二聚化。

（5）pGpp产生导致核糖体更快地脱离翻译，且不依赖核糖体休眠
在含高浓度KCl的多聚核糖体谱分析中，KCl可将缺乏肽酰-tRNA的空白核糖体解离为30S和50S亚基。诱导20分钟后，pGpp产生导致更多核糖体脱离翻译，比例显著高于(p)ppGpp产生；嘌呤霉素处理进一步增加解离亚基比例，且pGpp组增幅更大。在缺失hpf的菌株中，pGpp产生仍导致更快的核糖体脱离，说明HPF介导的二聚化不是核糖体脱离的原因，而是其结果。

（6）pGpp产生比(p)ppGpp产生更快重塑转录组
RNA-seq分析显示，警报素产生后翻译、核糖体结构与生物发生、核苷酸代谢等基因类别下调最明显，氨基酸代谢与转运相关基因上调。pGpp产生导致的差异表达基因总数多于(p)ppGpp产生，且整体差异表达幅度更大。例如，pGpp产生对hpf的激活和对pyrG的抑制均强于(p)ppGpp产生。此外，pGpp产生还诱导出现此前未报道的较大mRNA异构体。这些结果与pGpp产生时更快的GTP耗竭一致。

（7）没有警报素产生时NahA不影响转录组
为排除NahA本身可能具有的mRNA焦磷酸水解酶活性对转录组的影响，研究人员在(pp)pGpp0背景下比较了表达野生型NahA与催化失活NahAE49Q,E53Q的菌株。RNA-seq和rif-seq结果显示，在没有警报素产生时，NahA不会显著改变基因表达或mRNA半衰期，说明观察到的pGpp与(p)ppGpp产生之间的转录组差异确实来自警报素种类不同，而非NahA的焦磷酸水解酶活性。

（8）NahA的NuDiX基序对体外(p)ppGpp水解至关重要
体外水解实验表明，野生型NahA能将ppGpp和pppGpp水解为pGpp，而催化失活突变体NahAE49Q,E53Q完全丧失该活性。此外，NahA对(p)ppGpp的水解在含镁离子缓冲液中明显强于含锰离子缓冲液。这与其mRNA焦磷酸水解酶活性严格依赖锰离子的特性不同，说明NuDiX基序对不同底物的催化机制存在差异。

讨论部分指出，警报素产生可通过快速耗竭GTP来抑制翻译，而(p)ppGpp还可通过直接结合翻译GTP酶发挥抑制作用。翻译起始因子IF2在细胞中丰度远低于延伸因子EF-Tu和EF-G，因此翻译起始对GTP耗竭更为敏感，这可以解释多聚核糖体快速减少而延伸相对受影响较小的现象。pGpp产生导致更快GTP耗竭的可能原因包括pGpp对嘌呤合成与补救途径酶的抑制作用更强、NahA水解使(p)ppGpp合成更有利，以及pGpp对嘌呤合成基因的更强抑制等。研究结论可翻译为：总之，通过在不存在外源应激的情况下基因诱导pGpp和(p)ppGpp产生，研究人员的工作揭示不同警报素对GTP耗竭、转录组重塑和翻译抑制可产生不同影响；pGpp产生可促进翻译抑制，三种警报素在翻译和生理调控中发挥差异化作用。