土壤酶活性与苔藓生物监测作为喀斯特洞穴及其集水区环境状况以及有毒及潜在有毒元素污染的互补生物指示器：斯洛伐克贝雷斯托夫斯卡洞穴

《CATENA》：Soil enzyme activities and moss biomonitoring as complementary bioindicators of environmental status and toxic and potentially toxic element contamination in a karst cave and its catchment: Brestovská Cave, Slovakia

　　

•首次整合潜在毒性元素、土壤酶和苔藓对Brestovská洞穴的研究。
•镉和硒是主要污染物；仅镉超过了土壤限值。
•生态风险为中等且以镉为主（RI = 212），但污染负荷指数（PLI）< 1。
•苔藓和土壤酶活性是监测土壤重金属的敏感生物指示物。
•对游客和工作人员而言，非致癌风险和砷致癌风险均可接受。

引言
地下环境是地球上分布最广却又最少被理解的生态系统之一。洞穴是人类唯一容易进入的地下栖息地，为全面了解地下领域提供了一个独特的窗口（Culver和Pipan, 2019; Mammola等, 2021）。它们以一系列均一的无生命限制为特征：黑暗、几乎恒定的低温、接近饱和的相对湿度以及持续匮乏的营养物质，而其生物群落对此有着极高的适应性（Badino, 2010; Howarth和Moldovan, 2019）。洞穴缺乏光合作用，主要依赖于来自地表的异源有机质或原位化能自养作用，这导致其生物活动微弱，与地表栖息地相比环境变异性降低（Bella, 2005; Ficetola等, 2019）。上述特性使得洞穴成为重要的“天然实验室”，在其洞穴沉积物和岩溶沉积物中保存着历史气候数据（Bogdan等, 2023），然而，日益增长的旅游开发和全球气候的不稳定性正日益威胁这些脆弱的生态系统及其自然与文化遗产（Lunghi等, 2020; Vesper, 2019）。

这种敏感性在喀斯特环境中会进一步加剧。裂隙碳酸盐岩较高的透水性，加上稀疏且不连续的土壤覆盖，没有天然的过滤作用；因此，在地表引入的污染物会迅速通过基质-裂隙-导流网络传输到洞穴和泉水中（Giurginca等, 2010; Gutierrez等, 2004）。集水区内的农业、森林砍伐、城市化、采矿和废弃物处置会将受污染的水和营养物质输送至地下，在那里，添加的有机质会被微生物迅速同化，并可能间接改变洞穴气候和生物群落（Bobu?ská等, 2024; Munteanu等, 2012）。参观型洞穴的旅游活动引入了额外的压力，包括来自游客的异源有机输入、局部增温、酸化滴水的CO2水平增加、“灯花”以及可能致病的微生物，这些共同要求对游客数量进行系统监测和限制（Constantin等, 2021; Kukla等, 2018）。

最令人担忧的污染物是毒性及潜在毒性元素。这些元素的毒理学意义并不一致，对于对公众开放的场所，其中几种值得特别强调。国际癌症研究机构将砷、镉、镍化合物和六价铬均列为1类致癌物，即对人类有致癌性（IARC, 2012）。慢性砷暴露与皮肤、肺和膀胱癌症相关，还与皮肤病变、周围血管疾病和神经毒性有关；由于砷在富含角蛋白的组织中滞留，头发已被用作慢性暴露的综合指标（Yüksel等, 2010）。镉在肾皮质中积累，其生物半衰期长达数十年，除致癌性外，还会引起肾小管功能障碍和骨脱钙。铅没有已知的生理功能，是一种累积性毒物，影响神经、造血、肾脏、骨骼、心血管和内分泌系统，主要通过酶抑制和诱导氧化应激起作用（ATSDR, 2020; Yüksel等, 2017）；其对脆弱人群的影响最为显著，儿童吸收摄入铅的比例远高于成人，且易受不可逆的神经发育损害，而在怀孕期间，从母体骨骼中动员出来的铅会穿过胎盘，且尚未确立铅暴露的安全阈值（Lanphear等, 2019）。汞具有肾毒性和神经毒性，钴在慢性暴露下与心肌病和甲状腺功能不全有关（ATSDR, 2020）。硒是一种必需的微量营养素，其需求量与毒性之间的安全边际异常狭窄，慢性过量摄入会导致硒中毒，汞和硒在膳食暴露研究中常被一起测定，因为它们的摄入量相互关联（Hosseini等, 2013）。这些特性是本研究纳入人类健康风险评估的基础，在此应用的污染指数和风险评估框架在其他土壤和沉积物研究中也被成功使用过（Hosseini和Sobhanardakani, 2024; Khalijian等, 2022）。如砷、镉、钴、铬、铜、汞、镍、铅、硒和锌等元素是持久性无机毒物，排放量巨大，抵抗降解，在土壤、沉积物和水体中积累，在生物体内生物富集，并通过食物链以及经口摄入、吸入和皮肤接触到达人体（Herojeet等, 2015; Zhang等, 2022）。即使低剂量的慢性暴露也与多种疾病相关，特别是砷，它是一种公认的人类致癌物，与儿童不良健康影响有关（Park等, 2004; Zhang等, 2022）。由于喀斯特沉积物在时间上整合了这些输入，它们比单纯的水体保留了更长时间的人类活动影响记录（Vesper, 2019）。除了对人类健康的影响外，毒性及潜在毒性元素还会损害土壤健康，减少土壤生物多样性，抑制植物生长，并扰乱支持生物生产力的生物地球化学过程（Bini和Wahsha, 2014; Wahsha等, 2012）。

毒性及潜在毒性元素污染破坏了土壤生物功能，使得生物标志物对于其检测至关重要。土壤健康定义为土壤作为生命系统持续运作的能力，最有效的评价方法是使用基于敏感生物指示物的生物指标（Ferrarini等, 2014; Parisi等, 2005）。在土壤生物群落中，微生物群落是对污染的首要且最迅速的反应者，这归功于它们的敏感性以及在有机质动态中的核心作用（Burns和Dick, 2002）。土壤酶持续参与维持土壤生态、肥力和健康，现已广泛用于作为微生物活性的指标（Fornasier等, 2014; Zornoza等, 2009），并被提议作为理想的土壤质量指标，因为它们与营养物质循环紧密相关，对自然和人为变化高度敏感（Gianfreda等, 2005）。酶活性对干扰反应迅速，通常发生在总有机含量或物理化学性质发生明显变化之前，因此是评估土壤污染的有效预警系统（Wahsha等, 2017）。

这种预警能力具有元素和酶特异性，使得功能酶组合比任何单一指标都更具信息量。铜会抑制β-葡萄糖苷酶（Haanstra和Doelman, 1991）；铜、锌、镍、铅、镉和铬会抑制碱性磷酸酶（Donderski和Brzezinska, 2005）；重金属会抑制几丁质酶（Wyszkowska等, 2006）；而砷影响芳基硫酸酯酶，但对碱性磷酸酶影响不大（Shukla和Varma, 2010）。与这些机制一致，斯洛伐克采矿和喀斯特土壤中危险元素的积累减少了微生物生物量和功能多样性，其中脲酶、磷酸酶和荧光素二乙酸酯水解酶反应尤为强烈（Angelovi?ová等, 2015; Demková等, 2019）。因此，将酶活性测定与毒性及潜在毒性元素浓度结合，可以产生一种基于生物有效性的机制性扰动图景，这是单一地球化学或生物学方法无法提供的。

土壤酶和毒性及潜在毒性元素浓度表征了土壤相，而大气途径最好由互补的生物监测器来捕捉。苔藓最初由Goodman和Roberts（1971）提议用于生物监测，现已广泛用于监测空气污染。其广泛的分布、在多种条件下的高丰度以及缺乏真正的根系（抑制了从矿物基质中吸收元素），使其成为大气沉降的出色生物监测器。它们也是经济有效的，无需电源，并且可以同时记录多种元素（Demková等, 2019; Demková等, 2017）。

四个考虑因素定义了本研究的贡献。首先，尽管土壤酶活性、苔藓生物监测和地球化学指数评估都已应用于喀斯特环境，但它们此前从未与人类健康风险评估在单一洞穴系统中结合；可比的斯洛伐克喀斯特和采矿研究已表征了土壤污染和生态风险，但未能量化人类暴露（Bobu?ská等, 2024; Demková等, 2019）。其次，Brestovská洞穴直到2016年才向公众开放，因此现在建立有记录的参考状态，无论是否已检测到影响，都具有持久的价值。第三，采样设计是水文而非空间的：它遵循了系统从地表水进入的落水洞，穿过沿导流管道的五个点，到流出点的完整序列，并设有一个外部森林对照，而洞穴研究更常见的是只采样内部。正是这种结构使得能够识别入水区和出水区为外部输入的地点。第四，两个生物指示物区域被证明是互补而非冗余的，酶活性对基质的营养状态做出反应，而苔藓记录地表集水区的沉降，两者之间没有检测到关系。因此，这里声称的新颖性在于设计和参考数据，而非结果。

Brestovská洞穴是斯洛伐克西塔特拉山脉Rohá?e地区一条被活跃水流穿过的流水喀斯特洞穴，自2016年起全年对公众开放，提供了研究背景。本次调查的目标是：（i）表征洞穴土壤相对于地表的理化及微生物功能状态；（ii）量化十二种毒性及潜在毒性元素（砷、镉、钴、铬、铜、铁、汞、锰、镍、铅、硒、锌），并通过污染和生态风险指数与法规及参考值进行比较；（iii）评估毒性及潜在毒性元素与土壤生物指标之间的关系；（iv）评估游客和洞穴工作人员的人类健康风险；（v）表征元素沿水文序列的空间分布，并确定系统中暴露于外部输入最严重的部分；（vi）比较三个苔藓类群作为大气毒性及潜在毒性元素沉降生物监测器的积累能力。

研究片段
研究区
Brestovská洞穴位于斯洛伐克西塔特拉山脉Rohá?e地区的Zuberec村附近，是该地区最长的流水喀斯特洞穴，已知已测绘通道总长为2026米（Bella和Holúbek, 2007）。它位于Madajka山脉的林区，被归类为斯洛伐克的寒冷山区气候区；洞外气温在4到6摄氏度之间；洞穴内年平均气温

土壤样本中有毒元素的总含量
图2展示了在八个采样点测定的十二种毒性及潜在毒性元素的总浓度。在整个横断面平均计算，平均含量（毫克/千克干重）按顺序递减为：铁 > 锰 > 锌 > 镍 > 铜 ≈ 铅 ≈ 砷 ≈ 钴 > 铬 > 硒 ≈ 镉 > 汞。铁和锰在元素预算中占主导地位，这与它们的成岩和氧化物-氢氧化物行为相一致，而汞、镉和硒则以微量

局限性与未来展望
材料源自2019年9月在单一洞穴沿单一横断面上的八个站点进行的一次性考察。因此，该设计表征的是一种状态而非趋势：它无法解析季节或年际变化，也无法将任何观察到的模式归因于游客压力，这需要洞穴向公众开放前的数据或与不对游客开放的洞穴进行同期比较。这两者均未获得，因此未进行此类归因。空间分布

结论
本研究旨在通过在一个从落水洞穿过导流管道到出流点的水文定义横断面上，结合十二种毒性及潜在毒性元素的伪总含量、五种土壤酶活性与基础呼吸、三个类群的苔藓生物监测，以及一系列污染、生态风险和筛查水平的人类健康风险指数，为Brestovská洞穴喀斯特系统建立一个有记录的基线。该系统是一个于2016年向公众开放的参观型洞穴，研究从落水洞穿过导流管道到

CRediT作者贡献声明
Lenka Bobu?ská：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿撰写，可视化，监督，项目管理，方法论，调查，正式分析，数据管理，概念构思。
Lenka Demková：写作 – 审阅与编辑，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法论，数据管理，概念构思。
Mehdi Beheshti：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿撰写，正式分析。
Zuzana Vi?ňovská：写作 – 审阅与编辑。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能会影响本文报告的工作。

致谢
本研究由VEGA 1/0356/26项目支持。
Lenka Bobu?ská|Lenka Demková|Mehdi Beheshti|Zuzana Vi?ňovská|Tomá? Lo?ák|Ivona Jan?o|Július árvay