细胞内Ca2+平衡IL-33激活的肥大细胞(MCs)的抗炎潜力

《Cell Calcium》：Intracellular Ca2+ balances the anti-inflammatory potential of IL-33-activated mast cells (MCs)

　　

研究人员发现，IL-33可诱导p38和ERK1/2的激活；其中p38的激活受到Ca²⁺的限制，而ERK1/2的激活则依赖于Ca²⁺-钙调磷酸酶(CaN)-NFATc2模块。因此，Ca²⁺平衡了IL-33激活的肥大细胞的促炎与抗炎潜力。

该研究发表于《Cell Calcium》，旨在阐明IL-33激活的肥大细胞如何协调产生功能相反的细胞因子。肥大细胞作为外周组织中的哨兵细胞，可通过释放白细胞介素-6(IL-6)、IL-13等促炎细胞因子参与过敏与组织炎症，也可通过产生IL-2介导调节性T细胞(Treg)扩增，从而发挥抗炎作用。然而，调控IL-33激活的肥大细胞向促炎或抗炎方向分化的关键信号机制尚不清楚。研究人员以野生型(wt)和nfatc2^-/-小鼠骨髓来源肥大细胞(BMMCs)为主要模型，结合MC/9-p65/RelA-eGFP和MC/9-NFAT-eGFP报告细胞系，利用药理学抑制剂和基因缺陷细胞，揭示了细胞内Ca²⁺在平衡肥大细胞促炎与抗炎功能中的核心作用。

研究方法主要包括：采用免疫印迹检测TAK1、IKK2、IκBα、p65/RelA、ERK1/2、p38等信号蛋白的磷酸化水平；采用ELISA定量IL-2、IL-6和IL-13的产生；采用流式细胞术检测BMMCs的表面标志物表达及报告细胞eGFP活性；使用BAPTA-AM螯合细胞内Ca²⁺，环孢素A(CsA)抑制钙调磷酸酶(CaN)，Takinib抑制TAK1，U0126抑制ERK1/2，Skepinone抑制p38，Forskolin升高cAMP；并比较wt与nfatc2^-/- BMMCs的差异。BMMCs取自C57/BL6野生型和nfatc2^-/-小鼠骨髓，细胞经含IL-3的IMDM培养基诱导分化4周，纯度达95%以上c-Kit⁺/FcεRI⁺/IL-33R⁺后用于实验。

研究结果如下：

3.1 Ca²⁺选择性介导IL-33诱导的IL-2产生
BAPTA-AM仅显著减少IL-33诱导的IL-2产生，而不影响IL-6和IL-13；ATP对照实验证明所用BAPTA-AM浓度有效。BAPTA-AM还削弱了TAK1、IKK2、IκBα和p65/RelA的磷酸化，表明Ca²⁺对IL-33诱导的TAK1-IKK2/IκB-p65/RelA信号通路活化具有支持作用，但该通路受损后IL-6和IL-13仍能维持产生。

3.2 Ca²⁺平衡MAP激酶的激活
BAPTA-AM延长p38磷酸化时间，同时阻断ERK1/2磷酸化，说明Ca²⁺对ERK1/2活化是必需的，同时限制p38的过度激活，从而精确平衡ERK1/2与p38的活性。

3.3 Ca²⁺负向调控p65/RelA
在MC/9-p65/RelA-eGFP细胞中，BAPTA-AM反而增强IL-33诱导的p65/RelA转录活性；加入p38抑制剂后该增强效应消失，表明Ca²⁺限制p65/RelA转录活性，而p38可在TAK1-IKK2信号受损时维持p65/RelA转录功能。

3.4 p38和ERK1/2在IL-33诱导细胞因子产生中的作用
ERK1/2抑制剂不影响TAK1、IKK2、p65/RelA或p38的活化；p38抑制剂则增强TAK1磷酸化，但不影响IKK2、p65/RelA和ERK1/2。ERK1/2和p38抑制剂均阻断IL-2产生；IL-6和IL-13的产生严格依赖p38，仅部分依赖ERK1/2。因此，Ca²⁺调控的p38和ERK1/2是IL-33诱导细胞因子产生的关键协同因子。

3.5 TAK1介导IL-33诱导的肥大细胞信号转导
TAK1抑制剂Takinib完全阻断IL-33诱导的细胞因子产生，增强TAK1自身磷酸化，同时抑制IKK2、p38、ERK1/2和S536-p65/RelA的磷酸化及p65/RelA转录活性，证实TAK1是IL-33诱导MAP激酶和p65/RelA活化的上游关键激酶。

3.6 CaN是IL-33诱导IL-2产生所必需的
CsA选择性抑制IL-2产生，不影响IL-6和IL-13；CsA不影响TAK1-IKK2/IκB-p65/RelA通路和p38活化，但降低ERK1/2磷酸化，表明Ca²⁺通过CaN选择性激活ERK1/2-IL-2轴。

3.7 NFATc2未被激活但对IL-2产生必不可少
nfatc2^-/- BMMCs的增殖、分化、表面标志物表达和存活均与wt BMMCs无差异，但IL-33诱导的IL-2产生被阻断，IL-6和IL-13不受影响。MC/9-NFAT-eGFP报告细胞中，IL-33不能诱导eGFP表达，而离子霉素可诱导，说明IL-33不激活NFAT转录活性，但NFATc2仍以非经典方式参与IL-2产生。

3.8 NFATc2促进ERK1/2激活
与wt BMMCs相比，nfatc2^-/- BMMCs中IL-33诱导的ERK1/2磷酸化选择性降低。但Lyn、c-Src、Hck和Fyn等Src家族激酶表达未见异常，说明NFATc2缺失并非通过改变SFK表达而影响ERK1/2。

3.9 SCF通过CaN-NFATc2模块增强IL-33诱导的IL-2产生
干细胞因子(SCF)可提高细胞内Ca²⁺水平，并显著增强IL-33诱导的IL-2产生；该增强效应被BAPTA-AM、CsA或NFATc2缺失选择性阻断。SCF也能增强IL-6和IL-13产生，但这些增强不受Ca²⁺-CaN-NFATc2模块调控。

3.10 cAMP特异性抑制IL-2产生
Forskolin升高cAMP后，IL-33诱导的IL-2产生减少，而IL-6和IL-13不受影响，表明cAMP可通过降低Ca²⁺信号负向调控IL-2产生。

讨论与结论：讨论部分指出，BAPTA-AM虽然削弱TAK1-IKK2-p65/RelA通路，但通过延长p38活性并阻断IκBα再合成，维持了p65/RelA的转录输出和IL-6/IL-13的产生。Ca²⁺对p38的限制不依赖于CaN，可能涉及DUSP1和DUSP10等磷酸酶。Ca²⁺-CaN模块则可靶向KSR2支架蛋白，促进MEK1/2-ERK1/2通路的组装和激活。尽管IL-33不诱导NFATc2入核转录活性，NFATc2依然是IL-33诱导ERK1/2磷酸化和IL-2产生所必需的因子。研究结论表明，细胞内Ca²⁺水平是决定IL-33激活的肥大细胞功能极性的重要因素：当Ca²⁺水平较低时，IL-33主要激活p38-IL-6/IL-13轴，肥大细胞表现为促炎表型；当Ca²⁺水平升高时，Ca²⁺-CaN-NFATc2模块驱动ERK1/2-IL-2轴，使肥大细胞获得抗炎和免疫调节能力，从而平衡促炎与抗炎反应。该发现为理解肥大细胞在组织炎症和免疫调节中的双重作用提供了新的信号机制。