潘托辛A生物合成途径的阐明

《ACS Chemical Biology》：Elucidation of the Biosynthesis of Pantocin A

　　

潘托辛A是一种核糖体合成并经翻译后修饰的肽（RiPP）天然产物，通过抑制组氨酸生物合成途径发挥抗生素活性。产生潘托辛A的基因簇包含两个推定生物合成酶PaaA和PaaB的编码基因。此前研究已表明PaaA能够修饰前体肽的EEN核心序列，生成与潘托辛A最终结构相似但有所不同的双环结构；迄今尚无关于PaaB的鉴定报道。本文中，研究人员确定了PaaA产物的结构，解决了此前结构表征中遗留的歧义。此外，研究人员证明该产物可被PaaB识别为底物，PaaB是一种Fe(II)和2-酮戊二酸依赖性酶，催化独特的1,4-脱氢反应以完成成熟的翻译后修饰。这些研究完整阐明了潘托辛A的生物合成途径及其成熟过程所涉及的各个步骤。

**潘托辛A生物合成途径的完整阐明——PaaA与PaaB的酶学表征**

天然产物因其治疗价值而备受关注，其生物合成过程是新型酶催化化学的重要来源。核糖体合成并经翻译后修饰的肽（RiPPs）是快速扩展的天然产物类别，虽结构和功能多样，但共享共同的生物合成路线：核糖体产生包含核心区、N端前导区（leader）和C端尾随区（follower）的前体肽，经一个或多个修饰酶加工后分泌为成熟产物。潘托辛A（Pantocin A）是首次从成团泛菌（*Pantoea agglomerans*）中分离得到的RiPP天然产物，是目前已知最小的RiPP之一，为由两个谷氨酸残基（E16和E17）衍生出罕见双环基序的三肽，通过抑制组氨酸生物合成途径中的L-组氨醇磷酸氨基转移酶而发挥抗生素活性。其生物合成基因簇编码四种多肽：30mer前体肽PaaP、两个推定生物合成酶PaaA和PaaB，以及参与宿主免疫的DMT型转运蛋白PaaC。生物信息学分析提示PaaA属于ThiF/E1样酶家族，PaaB属于Fe(II)/2-酮戊二酸依赖性（Fe/2OG）加氧酶。此前研究虽已表明PaaA以ATP依赖方式修饰PaaP的E16/E17并伴随80 Da质量损失，但产物结构存在2a或2b两种可能而无法区分；PaaB则完全未被表征。本研究旨在解决PaaA产物结构的歧义、首次表征PaaB的催化功能，从而完整阐明潘托辛A的成熟途径。该论文发表在《ACS Chemical Biology》。

研究人员采用的关键技术方法包括：将来自成团泛菌（*Pantoea agglomerans*）的*paaA*与*paaB*基因经密码子优化后在*Escherichia coli* BL21 DE3中异源表达，并经Ni亲和层析和尺寸排阻色谱纯化；以胰蛋白酶消化结合液相色谱-质谱联用（LCMS）及串联质谱（MS/MS）监测反应并定位修饰位点；运用多维核磁共振（NMR）波谱（COSY、TOCSY、HSQC、HMBC、NOESY）对产物进行全结构归属；利用厌氧操作进行PaaB酶活测定。样本来源为成团泛菌的基因簇，无临床样本队列。

**通过胰蛋白酶消化的LCMS证明PaaA活性。** 研究人员利用LCMS分析PaaP的胰蛋白酶消化产物，未修饰PaaP（1-30mer）经酶切产生1-13mer片段（m/z 735.86，[M+2H]²⁺）；PaaA反应后对应片段2-13mer的m/z降至695.86（[M+2H]²⁺），与80 Da质量损失一致，证实了PaaA的催化活性。纯化过程中发现PaaA产物对酸性条件敏感，长时间暴露于0.1%甲酸会生成+18 Da的降解产物，因此HPLC纯化时流动相中不添加甲酸。

**PaaA反应产物的结构表征。** 研究人员对纯化的2-13mer进行多维NMR分析，1H,13C-HSQC谱显示烯烃区仅有一个峰（δH 4.83 ppm，δC 103.0 ppm），与2a或2b结构相符。COSY和TOCSY谱显示该烯烃信号与相邻亚甲基（δ 2.44/2.83 ppm，δC 33.0 ppm）相关，此亚甲基又连接一个次甲基（δ 4.62 ppm，δC 58.3 ppm）。由于2a与2b中耦合体系高度对称，区分二者依赖于酰胺质子化状态：2b中E17的酰胺氮因N–C键形成而无质子，但E16的酰胺质子应存在；2a则无酰胺质子与烯烃信号相关。TOCSY谱显示烯烃信号（4.83 ppm）、相邻亚甲基及次甲基在酰胺区（约7.5–8.5 ppm）均无交叉相关，而双键另一侧的亚甲基和次甲基均在8.09 ppm处存在TOCSY相关，由此将PaaA产物明确判定为2a。该结果与PaaA以ATP依赖方式激活E16的机制一致，与Fleming等人的结论相符。

**PaaB以2-13mer为底物且反应导致2 Da质量损失。** 研究人员异源表达并纯化PaaB后，在含PaaB、铁、2-酮戊二酸（2OG）和氧气的体系中，2-13mer（m/z 695.85）转化为3-13mer（m/z 694.85，[M+2H]²⁺），表明发生脱氢反应；同位素分布显示转化率>95%。MS/MS实验将2 Da质量损失定位于E16/E17修饰位点。去除PaaB、铁（外加EDTA螯合）或2OG均导致产物流失，证实PaaB为Fe(II)/2OG依赖性酶。值得关注的是，先进行胰蛋白酶消化再进行PaaB催化的产率显著高于先PaaB后胰蛋白酶消化的方式，提示PaaB反应可能发生于体内肽键切割之后。此外，缺少添加铁的体系中加入5 mM EDTA可完全消除活性，而缺少2OG时残留少量产物，被归因于PaaB共纯化的残余2OG。

**PaaB催化产物的结构表征。** 研究人员大量制备3-13mer并经HPLC纯化后进行NMR分析，其1H-NMR谱在5.12、5.21、6.18和6.36 ppm处显示四个特征峰，与天然潘托辛A的化学位移（5.12、5.21、6.15和6.35 ppm）高度一致。HMBC、NOESY和TOCSY实验完成了全结构归属，证实PaaB催化产物即为潘托辛A的成熟修饰结构。该产物与2a的简单1,2-脱氢产物不符：若在7位与8位发生1,2-脱氢，则相邻烯烃信号（6.36和6.18 ppm）和α次甲基（5.21 ppm）应存在TOCSY相关至酰胺质子的信号，而实际上仅有孤立烯烃（5.15 ppm）与E16酰胺质子存在TOCSY相关。因此PaaB催化的是脱氢伴随双键迁移，即净1,4-脱氢反应。

**讨论与结论。** Fe/2OG酶通常催化惰性C–H键的羟基化，但也已知多种替代转化。已有报道的Fe/2OG脱氢酶大多催化相邻碳中心的1,2-脱氢（如CarC、NapI、AsqJ、DfmD等），部分酶在复杂多环体系中伴随骨架重排（如SptF和PrhA），亦有羟基化伴随烯丙基双键迁移的实例。PaaB催化的净1,4-脱氢反应在Fe/2OG酶家族中尚属首次报道，是该酶家族催化多样性的新例证。机制上，PaaB催化可能经底物触发氧活化形成Fe(IV)-氧（ferryl）中间体，通过氢原子转移（HAT）启动反应；若初始HAT发生在2位，酰胺氮可能在电子转移步骤中提供杂原子辅助。本研究完整阐明了潘托辛A的生物合成途径：PaaP（1）经PaaA修饰生成双环骨架（2a），随后PaaB通过净1,4-脱氢和双键迁移完成成熟修饰（3），最终经两个肽键水解生成天然产物潘托辛A（3-3mer）。由于基因簇中无专用蛋白酶，肽键切割可能由PaaC或通用细胞蛋白酶完成。总体而言，本研究首次完整表征了潘托辛A两个生物合成酶的催化活性，解决了PaaA产物结构的长期歧义，揭示了Fe/2OG酶催化的新反应类型，具有重要的酶学与天然产物生物合成意义。