## 中文标题 采用温和冻融处理提升用于敏感化合物掺入的官能化PVA纳米纤维的稳定性

《ACS Omega》：Improvement of the Stability of Functionalized PVA Nanofibers for Sensitive Compound Incorporation by Gentle Freeze–Thaw Treatment

　　

组织工程的最新进展聚焦于增强模拟细胞外基质的纳米纤维材料的生物学性能。这些材料提供机械稳定性，并形成支持细胞黏附、迁移和生长的纳米纤维膜。其功能可通过掺入生物活性化合物（尤其是在水溶性聚合物基纳米纤维中）得到进一步提升，从而实现受控释放。然而，一个主要的限制是“突释”效应，即超过90%的包埋物质在最初24小时内被释放。第二个挑战是这些水溶性体系的稳定化。最常用的化学交联方法需要添加具有潜在毒性的化学试剂（交联剂），可能导致纳米纤维材料发生结构和化学变化，同时引起所掺入生物活性化合物的变性。本研究开发了一种基于水溶性聚乙烯醇（PVA）的官能化纳米纤维，采用先进的交变电流（AC）静电纺丝方法制备，并通过无毒性的冻融（FT）方法进行后续稳定化。这种物理稳定化技术避免了化学交联剂，而是通过聚合物链重组诱导结晶度提高，在保持结构完整性的同时降低溶解度。研究人员评估了FT稳定化对PVA纳米纤维的物理化学性质和溶解度的影响，以及其对富含生长因子的人血小板裂解物（PL）释放曲线的影响。结果表明，FT处理有效稳定了PVA纳米纤维，并显著减缓了所掺入PL的释放。具体而言，在+4 °C解冻条件下经过10次FT循环后，纯PVA纳米纤维的溶解度降低了19.5%，而在PVA + PL纳米纤维中，相同条件下PVA溶解度的降低幅度达到12.2%。PL本身的释放在10次FT循环后减缓了18.2%。在经FT处理的材料中还观察到结晶度的变化。该方法为开发用于慢性伤口治疗和皮肤再生的安全、功能性纳米纤维材料提供了一个有前景的平台。

## 论文解读

### 一、研究背景与拟解决的关键问题

水溶性聚合物在生物医学、制药、食品加工和化妆品等领域应用广泛，尤其在纳米纤维支架的构建中具有重要价值。在众多水溶性合成聚合物中，聚乙烯醇（PVA）凭借优异的生物相容性、无毒性和良好的机械性能，被广泛用于软性接触镜、伤口敷料和药物递送系统等医疗器械。然而，水溶性聚合物基纳米纤维在实际应用中面临两个关键挑战。其一是“突释”效应：当纳米纤维材料暴露于水性环境时，超过90%的包埋生物活性物质会在最初24小时内迅速释放，极大地限制了其作为缓释载体的功能。其二是稳定化难题：最常用的化学交联方法虽然能形成强共价键，但通常需要使用戊二醛等具有潜在毒性的交联剂，可能损害材料的生物相容性，同时导致所掺入的蛋白质等敏感生物活性分子变性失活。物理稳定化方法如紫外辐照、等离子体处理和热处理虽能避免有害化学品，但交联程度和机械强度通常低于化学方法。值得注意的是，针对PVA水凝胶和微球开发的稳定化策略无法直接外推至静电纺丝纳米纤维体系，因为纳米纤维的高比表面积、互连多孔网络及其与细胞外基质形态上的相似性使其对水介质中的溶解和结构完整性丧失尤为敏感。基于上述背景，研究人员提出采用冻融（FT）物理-热稳定化技术处理静电纺丝PVA纳米纤维，以期在温和、无毒的条件下提升其水稳定性和缓释性能。

### 二、研究内容与总体结论

研究人员以高水解度（98%–98.8%）和高分子量（125,000）的PVA为原料，配制10 wt%水溶液，采用交变电流（AC）静电纺丝技术制备了纯PVA纳米纤维以及掺入人血小板裂解物（PL）的官能化PVA + PL纳米纤维。PL是一种富含敏感生长因子的生物活性物质，来源于区域医院采集的人血小板浓缩物（浓度为738 × 10⁶ PL/mL），由四名供者的混合白膜层制备并去除了残留红细胞和白细胞，总蛋白浓度为15.9 mg/mL。随后，研究人员对所制备的纤维材料施加FT稳定化处理，循环条件为?20 °C冷冻16小时，随后分别在+4 °C、+22 °C或+37 °C下解冻8小时，循环次数为5次和10次。研究全面评估了不同FT条件对材料形貌、化学结构、结晶度、PVA溶解度以及PL释放行为的影响。结果表明，FT处理能够有效降低PVA纳米纤维在水中的溶解度，减缓PL的释放速率，且不引起纤维化学结构的改变或明显的形貌损伤。该物理稳定化策略为开发安全的、可用于慢性伤口治疗和皮肤再生的功能性纳米纤维材料提供了有前景的技术平台，论文发表在《ACS Omega》。

### 三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下几项核心技术方法开展研究。（1）AC静电纺丝技术：使用信号发生器（Owon AG 1022）耦合高压放大器（TREK 50/12C-H-CE）产生频率40 Hz、有效电压50 kV的方波交流电场，在螺杆泵恒速供液（14–18 mL/min）条件下于纺丝电极表面形成聚合物射流，经溶剂快速蒸发后在旋转收集滚筒上沉积形成纳米纤维膜。设备在捷克Technical University of Liberec机械工程学院自行组装。（2）FT物理稳定化处理工艺。（3）扫描电子显微镜（SEM）结合ImageJ图像分析进行形貌观察和纤维直径统计（每组随机测量400根纤维）。（4）傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于表征化学结构和蛋白质分布均匀性。（5）差示扫描量热法（DSC）测定材料热性能和结晶度。此外，PVA溶解度通过紫外-可见（UV–Vis）分光光度法测定，PL蛋白释放量通过Bradford法测定。统计学分析采用了Kruskal–Wallis检验（纤维直径）、双因素方差分析和Tukey多重比较检验（溶解度与释放曲线的曲线下面积AUC）。

### 四、研究结果与分析

#### 4.1 FT稳定化PVA基纳米纤维材料

**非官能化PVA纳米纤维材料的制备与形貌分析：** 通过AC静电纺丝制备的纯PVA材料生产率为5.6 ± 0.7 g/h，面密度为7.3 ± 0.5 g/m²，平均纤维直径为375 ± 100 nm。经5次或10次不同温度条件的FT循环后，所有样品的纤维直径均无显著变化（各条件平均值在360–385 nm之间），表明FT处理能够保持纳米纤维的形态完整性。形貌分析中观察到珠状结构，这归因于水的高表面张力和低挥发性导致溶剂无法在沉积前完全蒸发，是水性体系静电纺丝中的常见现象。

**FT后PVA纳米纤维的溶解度变化：** 未处理PVA纳米纤维在72小时内约有68.1 ± 2.7%溶解。经5次FT循环后，在+4 °C解冻条件下溶解度降低了15.3%（降至52.8 ± 2.9%），而在+22 °C和+37 °C解冻时分别仅降低4.2%和5.1%。10次循环进一步降低了溶解度：+4 °C条件下降幅达19.5%（降至48.5 ± 2.2%），+22 °C和+37 °C条件下分别降低12.1%和13.3%。AUC统计分析显示，5次FT?20/+4条件下累积PVA释放显著低于其他组；在?20/+4条件下从5次增加到10次循环未引起显著性的额外溶解度降低（但趋势明确），而在+22 °C和+37 °C条件下增加循环次数带来的降低是显著的。研究人员认为，+4 °C缓慢解冻时，聚合物链获得足够的迁移能力进行二次结晶和微晶重组，形成更大、更稳定的结晶域，提高了物理交联点密度，从而限制水渗透和聚合物链的水化。

**FT后PVA的化学结构和结晶度：** FTIR光谱显示所有样品均表现出PVA的特征吸收峰，无可见的峰位移或额外谱带出现，证明FT处理是纯粹的物理交联过程，未引起化学修饰。DSC分析显示所有经10次FT循环的样品结晶度略有增加，但所有测量值介于47.42%至48.86%之间，差异不显著，难以仅凭DSC结果明确建立结晶度与溶解度之间的直接关系。

#### 4.2 含PL官能化PVA纳米纤维的FT稳定化

**官能化PVA纳米纤维材料的制备与形貌分析：** 将PL掺入PVA溶液后进行AC静电纺丝，所得PVA + PL纳米纤维面密度为4.5 ± 0.7 g/m²，平均纤维直径为265 ± 70 nm，明显细于纯PVA纤维（375 ± 100 nm），这归因于蛋白质的加入改变了聚合物溶液的化学组成和可纺性。理论蛋白含量为15.9 mg/mL，载药效率达1.56%。5次和10次FT循环后纤维直径分别为260 ± 65 nm和255 ± 65 nm，无显著变化。

**FT后官能化材料的PVA溶解度与PL释放特征：** 基于纯PVA纳米纤维的实验结果，选用效果最佳的?20 °C/+4 °C FT条件进行官能化材料的稳定化。未处理PVA + PL样品在72小时内约61.1 ± 2.4%的PVA溶解；5次循环后溶解度降低5.1%（至55.9 ± 1.9%），10次循环后降低12.2%（至48.8 ± 2.1%）。PL释放方面，未稳定化样品在3天内释放的蛋白量达到每克材料15.4 mg，接近理论蛋白含量15.6 mg/g。5次FT循环使PL释放降低8.8%（至89.8 ± 1.8%），10次循环后降低18.2%（至80.4 ± 1.6%）。AUC分析证实FT循环次数的增加显著降低了PVA和PL的累积释放。尽管FT稳定化减缓了释放速率，大部分蛋白质仍在72小时研究窗口内释放，因此研究人员将其定位为延长局部蛋白质可用性而非长期缓释系统。考虑到面积为1 cm²的材料（面密度4.5 ± 0.7 g/m²）约含7.8 μg总蛋白，单个生长因子的量可能在数十至数百纳克范围，而生长因子发挥治疗作用所需的局部浓度为10–100 ng/mL，因此在实际应用中重复施加材料可能更为合理。

**FT后官能化材料的化学结构和结晶度：** FTIR光谱中，PVA + PL样品在1600–1690 cm^?1区域呈现蛋白质典型的酰胺键吸收带，证实蛋白质成功掺入。FT稳定化后该区域信号强度保持不变，说明FT处理未引起蛋白含量损失或分布不均。DSC分析显示含蛋白质的PVA材料结晶度低于纯PVA材料（未处理时约低5%），推测蛋白质的引入部分扰乱了聚合物大分子结构的规整排列。但随FT循环次数增加，结晶度仍表现出递增趋势（从未处理的42.11 ± 1.55%升至10次循环后的45.78 ± 2.18%）。

### 五、讨论总结与研究结论

讨论部分着重阐述了FT处理降低PVA溶解度的机理：在?20 °C冷冻过程中冰晶形成使PVA链富集于受限微区，促进链排列和微晶成核；而在+4 °C缓慢解冻时，链段获得适度迁移率进行二次结晶和晶体重组，形成更大更稳定的物理交联点，有效限制水分子扩散。相比之下，较高的解冻温度（+22 °C和+37 °C）因解冻速率较快，给予结晶重组的时间较短，物理交联强化效果较弱。对于蛋白质释放，FT处理形成的致密聚合物网络可能同时通过增加扩散路径长度和促进PVA与蛋白质间的氢键作用来协同减缓PL释放。与化学交联相比，FT方法避免了有毒交联剂的引入，在温和条件下保持了蛋白质的生物活性和纤维形态完整性。研究结论指出：FT交联能有效提高PVA纳米纤维在水中的稳定性，在?20 °C冷冻/+4 °C解冻条件下10次循环可使PVA溶解度降低19.5%，使PL释放降低18.2%，同时纤维结构和化学组成保持不变。该方法在再生医学领域具有广阔应用前景，尤其适用于大面积和慢性皮肤伤口的治疗，以及需采用温和稳定化手段的敏感生物活性物质的靶向递送。