基于胶原蛋白的高分辨率、可内部灌注支架的三维生物打印技术，用于构建完全生物学的组织系统

《ASN Publications》：3D bioprinting of collagen-based high-resolution internally perfusable scaffolds for engineering fully biologic tissue systems

　　器官芯片和微流控系统提高了体外系统的转化相关性；然而，当前的制造方法在材料选择、非天然机械性能、几何复杂性和细胞驱动的功能组织重塑方面存在限制。在这里，我们将细胞外基质（ECM）和细胞三维（3D）生物打印到基于胶原蛋白的高分辨率可内部灌注的支架（CHIPS）中，这些支架与血管和灌注器官芯片反应器（VAPOR）集成，形成了一个完整的组织工程平台。我们改进了悬浮水凝胶（FRESH）生物打印的自由形式可逆嵌入技术，通过一步过程制造出多种CHIPS设计。CHIPS表现出对灌注分子渗透性的尺寸依赖性，以支持细胞活力和迁移。最后，我们实现了多材料生物打印，以控制3D空间图案、ECM成分、细胞化和材料属性，创建了具有血管内皮钙黏蛋白+类血管网络的葡萄糖响应性、胰岛素分泌的胰腺样CHIPS。CHIPS和VAPOR共同构成了一个平台技术，用于疾病建模和细胞替代疗法的完整器官级功能研究。

引言：心血管系统是所有脊椎动物的发育要求，因为它将氧气和营养物质输送到组织和器官，并清除代谢废物。这种对可灌注流体网络的需求在生物工程领域提出了重大挑战，通常导致组织支架和设备的工程化要么将厚度限制在被动营养扩散的极限（约200微米），要么在较大结构中因缺氧而产生坏死核心（1, 2）。解决这一问题的一个关键方法是开发微流控和器官芯片系统来模拟血管流动和生物过程，包括肺芯片、微型心脏泵、多器官系统和三维（3D）血管网络（3–6）。这些微生理系统已被证明是研究血管生成和血管新生以及模拟不能在患者身上研究的人类疾病和药物反应的有用平台（7）。然而，微流控芯片的生产材料传统上是塑料和弹性体，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）（8, 9），其硬度比天然组织高几个数量级，可能会从培养基中吸收亲脂性生物分子，需要光刻和洁净室进行制造，不能被细胞重塑成更复杂的结构，且只能在体外使用（10, 11）。使用基于水凝胶的材料构建可灌注支架已被认为是一种克服这些挑战的方法，能够更好地模拟天然细胞外基质（ECM）（8, 12, 13）。使用光敏树脂（如聚丙烯酸酯）（14）和生物相容性水凝胶（如聚乙二醇）–二丙烯酸酯和明胶甲基丙烯酰（6）进行的高分辨率3D打印解决了一些问题，但通常限于单一材料，并且在设备制造后仍需通过灌注接种进行细胞化（15）。同样，使用牺牲聚合物的挤压3D生物打印可以产生可灌注的组织结构，但空间分辨率和设计复杂性有限（16, 17）。因此，尽管已经开发了多种制造技术，但在3D中空间图案化细胞、水凝胶、ECM和其他组件方面仍然存在限制，从而影响了可以构建的模型系统的结构复杂性和功能。

在这里，我们报告了将基于胶原蛋白的水凝胶、ECM和细胞直接3D生物打印到具有高精度结构和成分控制的完全生物可灌注支架中。为此，我们利用了悬浮水凝胶（FRESH）的多功能可逆嵌入能力（18, 19），将自上而下的可灌注水凝胶支架工程与自下而上的、由细胞驱动的自组装相结合，以跨越宏观（>1毫米）和微观（<1毫米）长度尺度。具体来说，我们将细胞、I型胶原、纤溶素和其他ECM成分生长因子生物打印到称为基于胶原蛋白的高分辨率可内部灌注支架（CHIPS）的复杂结构中。作为体内主要结构蛋白（20），I型胶原是作为CHIPS结构生物墨水的理想材料，因为它提供了机械强度，并定义了血管和组织隔室。此外，为了灌注这些相对柔软的基于胶原的支架，我们开发了一种称为血管和灌注器官芯片反应器（VAPOR）的新生物反应器系统来动态培养CHIPS。在计算机辅助设计（CAD）中快速迭代VAPOR和CHIPS设计并立即FRESH打印的能力，使得它成为一个高度模块化的组织工程平台。我们通过制造和验证了超过10种不同的CHIPS设计来展示这一点，包括在灌注培养下形成类似毛细血管网络的葡萄糖响应性、胰岛素分泌的胰腺样CHIPS。微流控CHIPS和VAPOR生物反应器共同构成了一个集成系统，可以重现已建立的微流控能力，同时实现将细胞与ECM蛋白（如胶原和纤溶素）结合成功能性厘米级组织系统的新类别。

结果：3D生物打印CHIPS的设计、制造和计量评估：CHIPS是通过将生物材料直接挤出到由明胶微粒浆组成的热可逆支撑浴中FRESH打印而成的。支撑浴通过两个关键功能发挥作用：（i）在打印过程中由于其宾汉姆塑性流变学特性而固定嵌入的生物墨水纤维；（ii）触发嵌入纤维的快速凝胶化或固化（图1A）（18, 19）。对于基于胶原的生物墨水（浓度范围为12至35毫克/毫升，在软组织中发现）（21），支撑浴的水相被pH缓冲以快速中和酸化的胶原并驱动纤维网络的自我组装。打印完成后，通过将温度升至37°C来去除支撑浴，从而熔化明胶，允许无损地取出打印件。虽然我们过去曾使用FRESH生产3D结构（19），但需要改进我们挤出材料的公差，以便成功生产具有可靠可灌注内部通道的单材料或多材料CHIPS。

制造、3D测量和FRESH打印CHIPS的灌注：(A) FRESH生物打印和释放过程的示意图。(B至D) CAD设计(i)；使用胶原生物墨水进行FRESH打印(ii)；体积OCT成像显示对胶原挤出和负空间的高精度控制，从而形成通畅的腔道（暗区域)(iii)；以及使用直方图对蛇形、三通道和堆叠通道内部网络设计的负空间腔道区域进行3D测量，以进行定量精度评估(iv)。(E) 从1毫米到250微米的多种尺度的血管床设计。(F) 用I型胶原FRESH打印的多尺度血管床。(G) 蓝色染料通过多尺度血管支架的灌注。(H) 体积OCT成像和横截面分析显示内部流体网络的腔道通畅性和圆形精度。(I) 3D测量多尺度血管腔道体积显示高精度打印，平均偏差<11微米。

在组织工程的背景下，血管化组织可以被视为由精确图案化的正空间（细胞、ECM等）和负空间（血管、淋巴管等）组成。作为一种增材制造工艺，3D打印通过精确放置或固化材料来逐层图案化正空间和负空间。我们的团队已经证明，通过改变FRESH打印过程中使用的针内径（ID），可以将单纤维分辨率调节到20微米（19）；然而，在实际应用中，纤维尺寸仅定义了给定对象的总分辨率的一部分。由于CHIPS的总分辨率取决于负空间和正空间的图案化，我们寻求测量这两种特征类型以定义可靠的内部灌注精度。我们的最初目标是改进FRESH打印过程，以提高纤维再现性（与预期直径的偏差）、机械精度（XY方向的纤维定位）以及逐层重复性（Z方向的层对齐），涵盖各种几何复杂性。

使用CAD，我们创建了受器官芯片设计启发的三厘米级微流控设备，这些设备最初是使用光刻或基于光的3D打印制造的。具体来说，我们制造了(i) 类似 Whitesides及其同事报告的设计的蛇形混合网络（22），内部通道尺寸为500微米宽×1000微米高（图1，Bi），(ii) 由狭窄的380微米胶原壁分隔的三通道设计，类似于Kamm及其同事的工作（23）（图1，Ci），以及(iii) 类似Ingber及其同事的肺芯片设计的堆叠通道设备（3），使用一步FRESH打印过程在Z方向上分隔多个通道，通道间距为400微米（图1，Di）。每个模型都被导入开源切片软件以生成称为G代码的3D打印机路径。G代码预览提供了逐层方式下 extruded 生物材料类型（外部周长、内部周长、填充物和表面）的可视化，以创建最终的3D结构（图S1，A至I）。为了确保CHIPS内的可灌注性，G代码中的所有正负特征必须准确且精确地匹配预期的CAD几何形状，因为最小可灌注通道直径由负空间的图案化决定，而不仅仅取决于挤出纤维的精度。虽然这看起来像是一个显而易见的限制，但对于CHIPS来说，只有35%的支架体积是由正 extruded 填充物组成的，剩余的65%体积作为负空间。

对蛇形、三通道和堆叠CHIPS的光学成像证实了使用I型胶原生物墨水的成功FRESH打印。FRESH打印的胶原的半透明性质使得在立体显微镜下能够看到内部可灌注网络，不透明的胶原边缘勾勒出了较暗的区域[图1，B (ii) 至 D (ii)]。此外，为了获得CHIPS整个3D体积的详细结构数据，我们使用了光学相干断层扫描（OCT）进行体积成像。这种非侵入性成像方式非常适合CHIPS，因为extruded胶原（RI = 1.41）和充满液体的空隙空间（RI = 1.33）之间的折射率（RI）差异形成了高对比度图像。对于每个CHIPS设计，OCT体积的XY、XZ和YZ横截面图像突出了extruded胶原纤维（白色）和负空间（黑色）的精确图案，从而产生内部通畅的通道[图1，B (iii) 至 D (iii)]。接下来，我们根据从OCT测量的五个参数确认了基于高精度挤出支架的适当机械校准：纤维直径X、纤维直径Y、填充物间距X、填充物间距Y以及层直度XZ。选择了Stacked CHIPS OCT XY横截面中的感兴趣区域（ROI），对应于第59层的填充物特征（图S1G），因为其定义了直线结构并且能够分辨出单个纤维和负空间（图S1，J和K）。在X和Y方向上打印的平均纤维直径量化为105 ± 9微米。这种轻微的纤维偏差超过90微米是由于在层与层堆叠过程中发生的纤维压缩，这与欠 Extrusion 相比提供了有益的机械强度和改善的层间粘附性。X和Y方向的填充物间距（测量3D打印机的机械精度和重复性）具有高度重复性，平均偏差小于10微米，垂直度为89.5° ± 1.2°（n = 30个交点）。最后，由于3D生物打印是一种逐层增材制造技术，随着每层的添加，可以测量堆叠层之间的Z方向对准情况，以确定垂直直度（图S1L）。使用OCT图像的XZ横截面，我们获得堆叠 extruded 纤维的平均层直度，与真实垂直期望值相差6微米以内（图S1M）。这些和其他测量（图S1N）对于确认CHIPS在打印后能够忠实再现设计的CAD模型以及生成高精度的正特征和无缺陷的负空间以可靠地创建可灌注的小直径通道至关重要。

验证CHIPS制造的最后一步是确定内部可灌注通道的打印精度。为了将可灌注网络与整体支架分离，创建了CHIPS的逆模型，并使用基于3D点云的配准过程与基于OCT图像的分割3D体积进行定量测量。该过程允许对CHIPS内打印的通道与原始CAD模型之间的偏差进行真正的体积测量。对于蛇形、三通道和堆叠CHIPS，整个体积的平均-overprint和underprint均方根（RMS）误差小于20微米（显示了模型特定RMS偏差的直方图）[图1，B (iv) 至 D (iv)]。这些参数共同定义了高保真度的打印效果，既适用于挤出的特征部分，也适用于负空间，突破了我们3D打印机机械运动控制系统的极限。此外，这些FRESH打印的CHIPS为基于挤出的生物打印技术设定了一个新的制造标准，因为所有测量到的误差都接近OCT系统的成像分辨率极限（XY方向16微米体素）以及我们生物打印机的机械性能（±8微米）。为了测试我们改进的高保真度打印过程的能力，并展示CHIPS设计的灵活性，我们设计了一个类似血管的网络，其圆形腔体从750微米的入口逐渐缩小到250微米的出口（图1E）。该设计通过FRESH技术打印完成（图1F和视频S1），并手动注入蓝色染料以验证网络的通畅性和通道壁的完整性（图1G）。基于OCT的定量图像分析确认了通道的通畅性，清晰地显示了各个胶原填充特征，以及分支段的平均直径分别为741 ± 15微米、492 ± 16微米和251 ± 32微米（图1H）。此外，通过将CAD设计的网络与打印出的CHIPS内的负空间OCT扫描数据进行对比，测得平均重印和欠印的RMS误差为11微米（图1I），这表明无论几何形状或网络设计如何，FRESH打印的CHIPS都能在通道的方形（图1，B至D）和圆形（图1，E至I）截面方面都表现出极高的保真度。这些例子还证明了使用任何硬件或软件平台，FRESH 3D生物打印都能实现最高保真度的胶原基生物打印，从而能够生产出多种多样的CHIPS设计。

与由PDMS、热塑性塑料和光敏树脂制成的器官芯片系统不同，后者足够坚硬，可以直接插入进出口导管进行灌注（13），较柔软的FRESH 3D生物打印CHIPS则需要一种新的灌注方法来确保流体流动并防止加压时泄漏。为了解决这个问题，我们开发了VAPOR生物反应器，它由两个部分组成：(i) 一个用紫外线（UV）固化的生物相容性树脂3D打印的主体，带有集成的Luer锁连接装置和内部流体通道；(ii) 一个可拆卸的盖子，包含硅胶垫圈和玻璃观察窗口（图2，A至D）。VAPOR的内部流体通道以带有倒钩的接头结尾，这是一个关键的设计特点，因为所有VAPOR CHIPS的负空间都被设计成了在组装时能够与进出口几何结构相互锁定的形式（图2A）。此外，VAPOR还包括一个类似淋巴液的流体路径，该路径将主腔室与一个单独的Luer锁连接装置相连，这不仅可以缓解初始组装过程中的压力峰值，还可以在主通道堵塞时提供流体旁路，并允许从CHIPS中扩散出来的间质液循环（图2Ai）。整个灌注电路还包括一个蠕动泵、介质储罐和气泡捕获器（图2E），整个装置放置在细胞培养箱中进行细胞灌注研究（图2F）。大多数灌注实验是在流量为100微升/分钟的情况下进行的，但我们验证了CHIPS能够支持至少1000微升/分钟的流量。对于一个高500微米、宽1000微米、长8毫米的通道，在37°C下使用粘度为0.78厘泊（cP）的EGM2培养基进行灌注时，壁面剪切应力约为3达因/平方厘米，这个值在大型静脉和小动脉报告的1至10达因/平方厘米范围内（25）。由于CHIPS和VAPOR都是3D打印的，因此进出口的整体尺寸、位置以及内部可灌注网络的布局可以轻松修改和迭代，以满足特定的实验需求。

**VAPOR生物反应器平台的设计与实现：**
- **图2.** (A) (i) VAPOR基座，(ii) 盖子和垫圈组件的CAD模型和示意图，(iii) CHIPS与VAPOR倒钩接口以实现防水密封，以及(iv) 通过VAPOR和CHIPS的双独立流动路径的示意图。 (B) 组装好的VAPOR系统的尺寸。 (C) 用红色和蓝色染料灌注VAPOR以可视化内部流体网络的图像。 (D) 立即灌注前的完整组装好的VAPOR和插入的蛇形CHIPS。 (E) VAPOR中使用的灌注装置示意图。 (F) 安装到细胞培养箱前的VAPOR平台和灌注系统图像。
为了评估灌注整合性能，我们设计了一种含有500微米宽、1毫米高的内部蛇形通道的CHIPS（图3A），通过FRESH技术打印（图3B和视频S2，A至D），通过OCT验证了腔体的通畅性（图3C和视频S2E），然后将其放入VAPOR生物反应器中进行灌注（图3D和视频S2）。我们的第一个目标是通过同时向入口注入红色和蓝色染料溶液，在CHIPS内部实现层流（图3E，雷诺数Re = 0.37）。视频延时成像显示，在蛇形通道中形成了两个明显的平行染料流，但由于路径长度较短，混合仅发生在染料界面处（图3F和视频S2）。接下来，我们进行了脉冲灌注实验，以促使酸性酚红溶液（起始为可见黄色溶液，pH 6.8）和碱性NaOH溶液（pH 11）之间的混合（图3G）。脉冲流动导致沿蛇形路径快速混合，并使颜色从黄色变为品红色（图3H和视频S2）。酚红pH指示剂的比色分析证实，随着流体力学的改变，pH值沿着通道从6.8变化到9（图3I）。

**FRESH CHIPS的VAPOR灌注：**
- **图3.** (A) 双入口单出口蛇形网络CHIPS的CAD设计，带有与VAPOR进出口匹配的倒钩形状切口。 (B) FRESH打印的蛇形CHIPS的立体显微镜图像。 (C) OCT体积成像和截面分析显示了通畅的500微米腔体（暗区）。 (D) 用红色和黑色染料灌注蛇形CHIPS的图像。 (E) 展示蛇形CHIPS中层流灌注实验的示意图。 (F) 用红色和蓝色染料灌注蛇形CHIPS的图像，展示了层流灌注和最小的界面混合。 (G) 使用酸性酚红指示剂和碱性NaOH溶液进行脉冲流灌注实验的示意图，展示了蛇形网络内的流体混合。 (H) 蛇形CHIPS中的脉冲流动产生了沿流体路径的混合梯度。 (I) 酚红被中和时，蛇形通道内pH值变化的定量比色分析。 (J) 用于与VAPOR接口的堆叠通道CHIPS的CAD设计。 (K) FRESH打印的堆叠CHIPS的立体显微镜图像。 (L) 通过FRESH生物打印胶原蛋白实现的堆叠通道的OCT XZ截面图像，突显了保真度和分辨率。 (M) 显示在VAPOR中开始灌注红色和蓝色染料的堆叠CHIPS的图像。 (N) VAPOR中灌注的堆叠CHIPS的概览图像。 (O) 3D螺旋CHIPS网络的CAD模型。 (P) FRESH打印的3D螺旋CHIPS的立体显微镜图像。 (Q) OCT体积成像和截面分析显示了通畅的圆形腔体（XY方向），以及YZ方向的投影图像以观察整个螺旋网络。 (R) 3D螺旋CHIPS在VAPOR中灌注210分钟后，低分子量染料（红色和蓝色）在整个CHIPS中完全扩散。

随着VAPOR平台的全面功能化，我们进一步展示了CHIPS设计空间的多样性，通过制造和灌注多层和螺旋通道设计来证明这一点。基于已建立的肺芯片模型（图1D）（3），我们设计了一种多层CHIPS，其中两个1000微米×600微米的通道在z轴上由400微米的胶原屏障分隔（图3，J至L；视频S2F；视频S3）。在堆叠通道中灌注红色和蓝色染料后，形成了两个独立的流体流，它们被胶原屏障分隔开来（图3，M和N；视频S3）。接下来，我们设计了一种包含双螺旋配置的两个圆形通道的CHIPS，以展示内部可灌注网络的体积三维图案化（图3O）。这种设计通过FRESH技术高保真度打印完成（图3，P和Q；视频S2G；视频S3），并进行了灌注实验，以展示小分子（约700道尔顿）红色和蓝色染料在3.5小时内向整个胶原支架中的时间依赖性扩散（图3R和视频S3）。在螺旋CHIPS中观察到的扩散是由于染料通过通道胶原壁的扩散以及通过内部开放晶格结构的扩散共同作用的结果，这种结构由正填充部分（35%）和负空间（65%）在G代码切片过程中定义。

**灌注CHIPS内的分子量依赖性扩散：**
为了进一步评估无细胞CHIPS内的分子扩散，我们设计了一种由薄500微米胶原壁分隔的双通道设计（图4A），以便进行高效的实时荧光分析。这些双通道CHIPS通过FRESH技术打印，通过OCT验证（图4B），然后在VAPOR生物反应器中进行灌注（图4C）。通过灌注和跟踪通道内的荧光微珠，确认了层流（雷诺数Re = 0.55）和通道的完整性（图4D和视频S4）。我们观察到层流颗粒分布，平均速度为0.91 ± 0.30毫米/秒（理论计算值为通道中心的1.2毫米/秒）。接下来，我们使用荧光异硫氰酸酯（FITC）标记的荧光葡聚糖（分子量3至70千道尔顿）作为源，在一个通道中，另一个通道中灌注1×磷酸盐缓冲液（PBS）作为汇进行仿真实验（图4E）。从葡聚糖灌注通道向外扩展的延时荧光成像（图4F和图S3，A和B）表明，整个CHIPS内的扩散是分子量依赖性的（图4G和视频S4）。3千道尔顿的葡聚糖在距离源通道1毫米处达到稳态扩散，而70千道尔顿的葡聚糖则需要约20小时达到稳态扩散。与铸态固体水凝胶支架相比，较大分子的扩散性显著增强（27）。为了增加分子扩散并模拟毛细血管后的收缩效应，我们在葡聚糖源通道和PBS汇通道之间施加了5或10毫米汞柱的压力差（图4H）。24小时后对PBS汇液的荧光光谱分析显示，在5或10毫米汞柱的压力增加下，系统PBS循环中的40千道尔顿葡聚糖含量显著增加（图4I）。比较高压（HP，+10毫米汞柱）和正常压力（NP）下的荧光强度比，显示压力增加促进了葡聚糖向PBS通道以及整个CHIPS和最远端区域的扩散（图4，J和K；图S3C；视频S4）。这些结果共同表明，具有广泛分子量的分子可以从CHIPS通道扩散到支架的主体内部，这是大多数由PDMS或塑料制成的微流控和器官芯片设备所无法实现的。此外，这些结果清楚地表明细胞可以优先沿着我们CHIPS模型填充物中的打印胶原纤维迁移。虽然静态培养条件足以诱导VE-Cad+的表达，但通过灌注施加剪切应力已被证明可以增加内皮细胞特异性蛋白的表达并促进类似血管的形态（30）。为了测试灌注在我们系统中的效果，我们对每种CHIPS设计进行了8天的VAPOR灌注培养。在具有纤维蛋白壁的CHIPS中（图S8D），我们观察到围绕打印通道的高水平VE-Cad表达（图S8E和视频S7），以及细胞沿流动方向在中央分隔区域的伸长（图S8F和视频S7）。同样，在经过8天灌注后，具有胶原壁的CHIPS显示出细胞在整个支架中的广泛迁移以及在支架内部形成了VE-Cad+的血管样结构。这些结构被检测到远离最初打印HUVECs和MSCs的位置（图6H）。此外，具有胶原壁的血管CHIPS在VAPOR灌注过程中没有变形，从而比只有纤维蛋白壁的CHIPS具有更高的通道通畅性（图6I和图S8D）。最后，我们观察到在VE-Cad+区域内的灌注刺激下形成了类似大直径微血管的形态（图6J和视频S7）。这些结果表明，添加胶原壁有助于加固CHIPS，促进VE-Cad+细胞的伸长，并防止支架变形，以确保血管CHIPS的持续VAPOR灌注。此外，由于灌注产生的增加的剪切应力，在仅仅8天的时间内就促进了细胞组装成直径跨越8至100 μm的VE-Cad+血管样网络。

接下来，我们尝试设计一个能够分泌蛋白质并展示结构复杂性和更高级功能的细胞化CHIPS系统。具体来说，我们关注的是由胰腺岛细胞执行的葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS），其功能障碍会导致1型糖尿病。胰腺组织的工程化已经取得了 several 进展，包括基于水凝胶的封装以逃避免疫系统（31,32）以及包含分离胰岛的器官在芯片（organ-on-a-chip）系统（33–35），这些研究表明植入产生胰岛素的工程组织具有治疗潜力（33–36）。然而，目前还没有完全由天然ECM和细胞组成的可灌注组织构建体具有未来的植入潜力。为了模拟胰腺组织的GSIS，选择了小鼠MIN6细胞，因为它们能够对葡萄糖作出类似β细胞的胰岛素分泌反应。MIN6细胞被纳入我们的血管生物墨水中，形成高浓度的（每毫升6000万细胞，总比例为50% MIN6 + 45% HUVEC + 5% MSC）基于纤维蛋白的胰腺样生物墨水。这种胰腺样生物墨水被FRESH打印到双通道CHIPS设计中，并通过OCT图像分析确认在8天的静态培养期间保持了几何稳定性（图S9）。我们的下一个目标是确认当HUVECs和MIN6细胞结合并作为单一细胞生物墨水打印时，它们是否表达了适当的血管和胰岛标记物。胰腺样CHIPS被FRESH打印并在静态培养8天，以允许足够的时间内形成血管样网络和胰岛素表达（图S10, A至C）。在固定和成像CHIPS后，我们观察到在细胞打印区域有密集的细胞化现象，以及细胞向周围胶原支架的迁移（图S10D）。此外，整个培养期间内部CHIPS结构得到保持，这通过通畅的流体通道得到证明（图S10E）。MIN6细胞在中央分隔区域和相邻的通道壁中呈现胰岛素阳性反应（图S10, E至G）。此外，在打印的细胞化区域内，CD-31+染色标记了毛细血管样网络的形成（图S10H），并且细胞迁移受到打印胶原纤维角度的引导（例如表面上的45°）（图S10, I和J）。这些结果共同表明，CHIPS内打印纤维的拓扑结构和方向可以作为定义细胞迁移、网络密度以及可能的血管样分支的潜在路径。此外，我们展示了结合HUVEC-MSC-MIN6的胰腺样生物墨水既能促进CD-31的血管样表达，也能促进胰岛素的胰腺样表达。

我们还评估了由于这些设备中的细胞浓度增加而带来的CHIPS物理稳定性。在距离胶原支架200 μm的区域内，远离细胞区域的地方，纤维图案形成了交叉阴影填充图案，细胞迁移遵循纤维方向（图S10, K和L）。当检查内部变形时，我们观察到填充物晶格间距的变化很小（378 ± 30 μm，而理论值为391 μm）。我们确实观察到纤维宽度有所增加（116 ± 18 μm，相比之下培养前的宽度为106 μm），这可能是由于细胞迁移覆盖了胶原纤维和/或随时间轻微膨胀所致。此外，填充物空隙距离从301 μm减少到269 ± 20 μm，表明CHIPS的内部结构在8天内是稳定的。因此，对于这种特定的CHIPS设计，根据所测量的指标，变形最多约为10%，最显著的是随着细胞迁移和覆盖最初无细胞的胶原，填充物孔隙率减少了。虽然静态胰腺样CHIPS确实表现出胰岛素表达，但我们构建体的大部分体积仍然是无细胞的。原则上，由于我们的整个支架都是由ECM制成的，我们可以通过在可灌注通道周围打印额外的细胞化区域来增加CHIPS内的总细胞体积。因此，设计了一种改进的胰腺样CHIPS，在每个可灌注通道的旁边和之间有三个不同的细胞化区域，使打印的细胞体积增加了50%。此外，为了加强设备并在VAPOR灌注过程中防止细胞介导的变形，我们在通道内衬周围加入了胶原壁，类似于我们的血管样CHIPS（图7A）。CHIPS成功进行了FRESH打印，并在静态培养12天后，显示出细胞向邻近无细胞区域的广泛迁移（图7B和视频S8）。值得注意的是，最初无细胞的胶原通道内衬现在有了一个包含可见血管样网络的细胞化管腔（图7C，图S11A和视频S8）。除了细胞向流体通道内和周围的迁移外，还观察到细胞向周围胶原支架的广泛迁移，直至距离最初打印区域一整毫米的位置（图S11, B和C）。再次，通道管腔保持通畅，最初无细胞的壁现在被细胞密集填充（图S11, D至G）。量化通道之间形成的分支内皮细胞网络显示平均直径为9.3 ± 2.7 μm（图7C和视频S8）。由于12天的延长培养，细胞在CHIPS填充物空间内迁移了数百微米，并继续沿着打印的胶原纤维迁移（图7D和视频S8）。

FRESH打印的血管胰腺CHIPS展示了血管生成和胰岛素分泌。（A）双通道多材料CHIPS的示意图设计和3D打印机机器路径G-code，其中包含胰腺血管细胞生物墨水（MIN6、HUVEC和MSC）区域，围绕通道的两侧。（B）经过12天静态培养后，通过明场立体显微镜（插图）和3D共聚焦荧光成像观察到的胰腺CHIPS。 （C）来自12天静态培养的胰腺CHIPS的XY中间平面视图，经过3D血管网络分割后进行网络直径和密度的量化。（D）示例共聚焦荧光图像显示，在打印胶原纤维引导下，细胞向CHIPS无细胞区域内的进一步迁移。（E）来自12天VAPOR灌注的胰腺CHIPS的3D共聚焦荧光成像的XY中间平面投影视图。（F）图形插图和示例ROI，展示了早期MIN6胰腺芽和微管腔形成的证据，以及来自ROI 2和3的肌动蛋白（绿色）和胰岛素（洋红色）荧光图像。（G）图形插图和来自1.5小时葡萄糖刺激[高葡萄糖（HG）与低葡萄糖（LG）]胰岛素分泌实验的胰岛素分泌ELISA测定量化结果（平均值±标准差；**P < 0.01，N = 3个静态组织；N = 2个灌注组织，未配对t检验）。

接下来，我们在VAPOR生物反应器中灌注胰腺样CHIPS 12天，以改善营养输送、增加细胞增殖和生长，并增强MIN6胰岛素分泌。灌注增加了细胞化程度，并揭示了细胞从打印的细胞区域向内迁移以覆盖通道管腔，并沿胶原纤维向外迁移（图7E，图S12，和视频S9）。最初无细胞的通道管腔现在显示了VE-Cad+细胞层（图S12, A至C），同时我们在填充物空隙空间观察到新的VE-Cad+单血管样束和直径从25到100 μm的Y形分支网络（图S12, D至G，和视频S9）。在所有打印的细胞区域内，灌注增加了胰岛素表达，而在远离打印细胞区域的地方也检测到了胰岛素+结构（图7E和视频S10）。最令人兴奋的观察结果是存在包含胰岛素+ MIN6细胞和肌动蛋白+ HUVECs和/或MSCs的循环结构，这些结构让人联想到胰岛发育过程中的早期胰腺形态（图7F和视频S10）（37–39）。灌注后的物理尺寸与静态培养不同，通道宽度和高度显著增加（图S13）。在静态和灌注条件下，通道高度都小于通道宽度（图S13B），这可能是由于组织清亮过程中脱水以及为了防止图像瓷砖扫描时通道压缩所致。灌注CHIPS的通道周长也增加了，表明伴随流体流动的正压力抵抗了细胞压缩力，保持了通道的通畅（图S13C）。同样，灌注胰腺样CHIPS的进气和出气间距与原始CAD设计非常接近，并且显著大于静态CHIPS（图S13, D至H）。

为了确认MIN6胰岛素+染色表明是对葡萄糖刺激的功能性分泌，我们进行了GSIS测定，并结合了胰岛素酶联免疫吸附测定（ELISA），比较了静态培养和灌注培养的胰腺样CHIPS。GSIS结果显示，静态培养的胰腺样CHIPS产生了2的刺激指数（SI），而灌注培养的CHIPS则显示出显著更高的SI，为4.6（图7G）。这表明胰腺样CHIPS的性能超过了之前关于MIN6伪胰岛球体的报告，并接近于初级胰腺胰岛（SI约为10）（33–35, 40–43）。最后，我们量化了24小时内分泌到灌注介质中的胰岛素量，检测到胰腺样CHIPS产生了>8 ng的胰岛素。总的来说，这些结果表明，在完全生物学的可灌注3D ECM环境中生物打印类β细胞的MIN6，在内皮细胞和基质细胞的存在下，促成了具有响应性和组成性分泌功能的工程组织构建体的形成。尽管这些初步研究表明胰腺样CHIPS具有转化潜力，但通过多种方法进一步的功能改进仍然是可能的，包括增加构建体中的类β细胞体积、延长培养时间以促进细胞成熟，以及结合完全分化的源自人类iPSC的类β细胞簇或人类初级胰岛。

在这项工作中，我们开发了一个先进的支架生物制造平台，该平台基于FRESH 3D生物打印CHIPS，实现了具有比任何其他基于挤出的生物打印方法更高分辨率和打印保真度的微流体网络设计。通过使用CAD轻松迭代支架设计，我们实现了快速迭代和可重复的多材料生物制造，使用了三种不同的生物墨水。这种CHIPS方法允许精确工程化复杂的组织结构，推进了生物制造的 ?? 性极限。这一切结合了我们的可定制灌注生物反应器系统VAPOR，该系统具有与基于胶原的CHIPS无缝连接的集成倒刺接头，从而实现长期灌注。该系统确保工程组织获得必要的营养和氧气，更接近自然生理环境。额外的进展包括一种对准系统，该系统可以促进在CHIPS内精确地对多种ECM、细胞和富含蛋白质的生物墨水进行局部空间排列，在厘米级支架内实现±20 μm的分辨率；以及一种直接打印方法，这种方法消除了3D打印后对支架进行灌注播种的繁琐过程。总体而言，这项技术为器官-on-a-chip系统、疾病建模和功能性组织结构的创建提供了以前尚未发现的能力。与现有的微流控技术相比，CHIPS和VAPOR的结合既有优势也有局限性。使用光刻技术制造的微流控技术在产生10 μm级别的小特征方面表现出色，而这些特征使用基于挤压的生物打印技术仍然难以复制。在我们当前的系统中，创建可灌注通道的最低限制约为100 μm的直径。然而，这并非受到我们3D打印机的精度（200纳米分辨率）或针头尺寸（小至20微米）的限制，而是受到支撑浴中明胶微粒平均大小的影响。目前，微粒的平均大小约为25微米，因此为了考虑到浴中的随机排列和凝胶化前的纤维扩散，最小的可灌注通道直径需要几倍于微粒的宽度。用于制备支撑浴的共凝聚过程可以进行微调，以生产更小的约10微米的微粒。虽然这为未来的研究提供了提高分辨率的途径，但我们预计即使有了这些改进，CHIPS的最小通道直径也约为50微米。幸运的是，内皮细胞和周细胞可以自我组装成更小的毛细血管级别的血管，这可能不必在CHIPS中追求更高的分辨率。细胞化的CHIPS在整个打印的胶原纤维上展现出广泛的细胞迁移，自我组装成由VE-Cad+和CD-31+细胞组成的类似血管的网络，这些区域在传统的微流控设备中通常是无法到达的。CHIPS还能够将多种细胞和材料图案化成复杂的三维结构，这是在微流控设备制造后通过灌注播种无法实现的。无论是使用灌注播种还是直接打印HUVECs哪种方法更好，目前仍然是一个未解的问题，这可能取决于具体的应用场景。在微流控（44, 45）、3D生物打印（46, 47）以及去细胞化/再细胞化（48, 49）中，内皮细胞的灌注播种一直是事实上的标准，因为到目前为止，其他可行的选择较少。虽然这种方法在基本层面上有效，但继续挑战灌注播种的一个问题是实现整个管腔表面的均匀内皮细胞覆盖（50）。我们的结果显示，灌注播种在CHIPS中也可以在静态条件下产生内皮细胞单层，但在低剪切应力（约0.1 dyne/cm2）下细胞会脱落。虽然可以通过修改胶原生物墨水来提高细胞粘附力来解决这个问题，但我们尝试了一种不同的方法。相反，我们使用FRESH 3D生物打印技术，在通道内直接细胞化HUVECs，与其一起使用纤维蛋白生物墨水。虽然我们没有观察到与静态播种相当的内皮细胞单层的形成，但我们仍然能够图案化活细胞，这些细胞随后会迁移到整个CHIPS中，并在从打印通道延伸到整个支架的内部形成类似毛细血管的网络，这是一个独特的结果。与传统的灌注播种相比，这种直接细胞化方法的潜在局限性在于实现连续的内皮样表面所需的培养时间较长。由于HUVECs嵌入在纤维蛋白生物材料中并且必须迁移到通道内，因此这一过程需要额外的时间。目前认为，通过静态培养预血管化的组织会产生原始的、未成熟的血管网络，当这些网络与宿主血管系统吻合时，会导致血流缓慢并在网络内形成血栓（51, 52）。由于血流是血管网络形成和重塑的关键信息来源，基于灌注的培养有可能精细化这些预血管化网络。如果目标是形成内皮细胞单层，那么在CHIPS通道上预涂覆Fn或其他ECM可能有助于克服施加剪切应力后观察到的细胞脱落问题。总体而言，直接细胞化通道内腔的方法通过提供一种额外的途径来构建内皮化的通道，从而扩展了基于灌注播种的方法。对于任何新技术，都可能存在关于使用便捷性和采用率的问题，因为这需要定制设备、技术知识以及整体成本；然而，我们不认为这会成为CHIPS和VAPOR的障碍。特别是，FRESH 3D生物打印技术已经有广泛的采用记录，这得益于发布了多种开源的3D生物打印机硬件设计，并提供了年度培训研讨会。在这里，我们使用了一种基于商用Aerotech运动控制平台的定制三材料生物打印机，其精度达到1微米，类似于多个学术实验室中的系统（53–56）。尽管这种硬件能够产生出色的结果，但它并不是高保真FRESH打印所必需的。要可靠地创建CHIPS，用户需要一台精度达到20微米或更好的3D打印机。这一性能标准与大多数商用3D打印机的规格相当，例如CellInk Bio X6，其报告的精度为1微米，并且官方支持FRESH打印。通过我们发布的指南，也可以使用价格合理的（例如<1500美元）桌面塑料3D打印机（如FlashForge Finder，报告精度为11微米）以及开源的注射泵 extruders和Duet3D电子元件来实现这一性能（19, 57）。在这里，我们利用我们的开源光学针头对准系统扩展了多材料打印的能力，该系统在x、y和z轴上的精度约为3微米。通过精确对准的针头，我们的单材料打印的保真度延伸到多材料打印中使用的每种额外生物墨水。尽管针头对准增加了额外的设置，但我们当前的系统始终能够产生误差小于20微米的打印结果。此外，为了促进我们技术的采用并降低入门门槛，在过去的5年里，通过卡内基梅隆大学举办的面对面的开源3D生物打印研讨会，已有超过50个实验室接受了FRESH技术的培训（58, 59）。同样，VAPOR生物反应器也是使用广泛可用的商用立体光刻（SLA）3D打印机（如Form3B）和现成的生物相容性光敏树脂制造的。此外，从STL（网格化零件文件）到3MF（3D制造格式）文件格式的广泛转换极大地提高了FRESH的传播潜力，因为3MF文件将3D CAD模型和所有软件切片设置嵌入到一个文件中。另一个用户可以打开这个文件并根据需要进行复制或编辑。与STL相比，3MF文件促进了实验室间的全球共享，并使熟悉FRESH的用户能够无需独立优化即可使用先进的功能。展望未来，完全生物支架的开发是由我们长期目标是设计用于治疗应用的功能性体积组织所驱动的。微流控中使用的标准材料，如PDMS、塑料和光敏树脂虽然具有植入潜力，但缺乏广泛的宿主细胞渗透、重塑和体内整合的能力。事实上，这些生物材料由于异物反应而广泛被认为会引发纤维化包封（60）。相比之下，无细胞的FRESH打印胶原支架已在体内植入，并显示出支持广泛的细胞渗透和宿主介导的血管化的能力，且没有任何纤维化的证据（19, 61）。这种生物墨水也用于CHIPS中，因此只要我们整合的细胞与宿主兼容，生物反应应该是相似的。尽管微流控启发的设计是我们当前工作的起点，但我们认识到CHIPS将需要针对特定应用的体内植入进行设计修改。值得注意的是，我们的结果表明，与静态培养的对照组相比，体外VAPOR灌注促进了腔道开放性，可能抵抗细胞压缩。因此，如果可灌注的流体网络可以直接与宿主血管系统吻合，那么血流和压力将维持血管的开放性。此外，CHIPS中的胶原浓度可以在很宽的范围内调整，还可以加入其他类型的胶原（包括II型和III型纤维状胶原）来调整支架的稳定性（62）。体内稳定性可能还需要改变CHIPS的进出口终止方式，以包含高浓度的胶原缝合袖口样区域，用高浓度的胶原结构加固无细胞区域和/或加入结构增强纤维（63），以减少体内压缩。最后，FRESH打印已经证明了能够在每毫升含有1亿到5亿个细胞的浓度下打印富含细胞的纤维蛋白基生物墨水（19, 64, 65），这高于任何其他生物打印方法。因此，CHIPS中的细胞密度可以根据需要定制，以在更小的空间内实现更大的细胞质量，从而最大化患者的潜在治疗剂量。例如，这里开发的类似胰腺的CHIPS虽然最初是作为体外应用开发的，但可以适应于研究VAPOR灌注和随后的宿主植入后的细胞重塑和长期体内稳定性和功能。总之，CHIPS和VAPOR平台代表了3D生物打印技术的重大进步，它将高分辨率的FRESH打印与动态灌注系统结合起来，用于设计复杂的功能性、厘米级的组织结构。这种方法通过实现精确的三维多材料生物制造、直接隔室细胞化、类似毛细血管的网络形成以及组织规模的分泌功能，推动了组织工程的可实现性的边界。尽管仍存在一些挑战，如优化微通道分辨率、增强流动状态下的内皮稳定性以及改进体内整合，但该系统的灵活性和可访问性为更广泛的采用和未来的创新铺平了道路。

**材料与方法**
**3D生物打印机设置**
所有FRESH打印都是使用我们开源的Replistruder 5注射泵（57, 64, 66）在定制的3D生物打印机上执行的（相关零件文件可在发布时根据CC-BY-SA许可证下载，网址为https://3d.nih.gov/users/awfeinberg）。单材料打印使用了一个定制的龙门架3D打印机配置，该配置由四个Parker Hannifin 404 × R 100 mm移动精度阶段驱动（移动精度为8-μm），如前所述（64）。对于多材料细胞生物打印，设计了一个使用AGS1000平台（Aerotech Inc.）的高性能运动控制系统。三个Replistruder 5注射泵和一个dovetail安装的OCT扫描头（Thorlabs）分别安装到了TU-30线性滚珠丝杠阶段（IKO）上，以独立驱动每个 extruder。定制的生物打印机平台的构建体积为100 mm（X）、300 mm（Y）、100 mm（Z）和每个TU-30 Replistruder 5子阶段的80 mm。使用的注射器容量为500-μl、1-ml或2.5-ml（Hamilton），其中含有生物墨水，针头直径分别为90-μm（用于胶原，Jensen Global，JG34-0.25HPX）或150-μm（用于细胞生物墨水，Jensen Global，JG30-0.5HPX）。

**胶原生物墨水制备**
除非另有说明，所有打印都使用了酸化的胶原生物墨水（23 mg/ml），制备方法如前所述（19）。简而言之，无菌中性胶原生物墨水（35 mg/ml；LifeInk 200，Advanced Biomatrix，5278）以2:1的体积比稀释0.24 M醋酸（VWR，97064-482），或者无菌酸化的胶原生物墨水（35 mg/ml；LifeInk 240，Advanced Biomatrix，5267）以2:1的体积比稀释无菌去离子水（DI），并在两个配对的注射器之间来回混合40次。对于荧光生物墨水的制备，1 ml的酸化胶原生物墨水与10到20 μl的人类Fn（500 μg/ml；Corning，356009）混合，Fn荧光标记有Alexa Fluor 405、488、555和633 N-羟基琥珀酰亚胺酯（67, 68）。在多材料打印实验中，胶原生物墨水中Fn的最终浓度为50 μg/ml。一些荧光标记的生物墨水还含有VEGF [重组人VEGF-165（PEPROTECH，100至20 ng/ml）]。在所有情况下，含有无细胞生物墨水的注射器在室温下以3000g离心5分钟，以去除制备过程中产生的气泡。然后，生物墨水被转移到Hamilton玻璃注射器中用于打印。

**细胞培养**
除非另有说明，细胞在37°C和5% CO2条件下培养，培养基中添加了1%（v/v）的青霉素-链霉素，每2天更换一次。混合的HUVECs（Lonza，CC-2519）在endothelial细胞培养基（Lonza，EGM-2，CC-3162）中培养。骨髓来源的MSCs [美国类型培养收集（ATCC），PCS-500-012] 在涂有快速涂层溶液的烧瓶中培养，并加入生长培养基（ATCC，PCS-500-041）。成人人类真皮微血管内皮细胞（HDMECs）（Lonza，CC-2543）在涂有快速涂层溶液的烧瓶中培养，并加入微血管内皮细胞培养基（Lonza，EGM-2 MV）。 MIN6（小鼠胰岛素瘤细胞系）（Addexbio，C0018008）在高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco，11-965-092）中培养，该培养基含有15%胎牛血清（v/v）、2 mM丙酮酸钠、20 mM Hepes和0.05 mM β-巯基乙醇，使用了9到15代的细胞。MIN6细胞的接种密度为2 × 10^4个细胞/平方厘米，并在细胞达到80%到90%汇合度时进行传代。

细胞生物墨水的制备
血管和胰腺生物墨水是按照类似的方案为细胞生物打印实验准备的。对于血管生物墨水，HUVECs（第4到6代）和MSCs（第2到4代）按照先前描述的程序进行培养，并使用胰蛋白酶-EDTA溶液分离。胰蛋白酶用含有7.5 μM双加利鲁定（Cayman Chemical，23035）的胰蛋白酶中和溶液以1:2的比例进行中和，双加利鲁定作为凝血酶抑制剂。细胞以200g的离心力离心5分钟，然后重新悬浮在1 ml的Hanks平衡盐溶液（HBSS，Gibco，14175-095）中。将1 × 10^6个MSCs和9 × 10^6个HUVECs转移到1 ml的BD注射器中。该注射器以190g的离心力离心5分钟，然后吸出上清液，直至剩余约100 μl。将165 μl的120 mg/ml纤维蛋白原（MilliporeSigma，341573）和65 μl的5%黄原胶（溶解在HBSS中）加入到另一个500-μl的Hamilton密封注射器中。将1 ml和500-μl的注射器通过Luer锁适配器连接起来，然后将纤维蛋白原、黄原胶和细胞混合50次。血管生物墨液在1 ml的注射器中以300g的离心力离心3分钟以去除气泡，然后转移到500-μl的注射器中。最终的血管生物墨液含有30 × 10^6个细胞/毫升、60 mg/ml的纤维蛋白原和1.0%（w/v）的黄原胶。胰腺生物墨水的制备与血管生物墨水类似，但有所调整。使用胰蛋白酶溶液分离MIN6细胞（第9到15代）5分钟，然后将10 × 10^6个MIN6细胞加入到1 ml的注射器中的1 × 10^6个MSCs和9 × 10^6个HUVECs中。最终的胰腺生物墨液含有60 × 10^6个细胞/毫升（30 × 10^6个MIN6细胞/毫升、27 × 10^6个HUVEC细胞/毫升、3 × 10^6个MSC细胞/毫升）、60 mg/ml的纤维蛋白原和1.0%（w/v）的黄原胶。

FRESH支持浴的制备
细胞化的CHIPS使用根据制造商说明制作的无菌支持浴（LifeSupport，FluidForm）进行打印。在打印基于胶原蛋白的生物墨水时，支持浴用2:1的冷100 mM Hepes（pH 7.4）（Corning，60-034-RO）和无血清DMEM（Gibco，11-965-092）混合物进行重新水化。在打印基于纤维蛋白原的生物墨水时，支持浴用冷100 mM Hepes（pH 7.4）和1 U/ml的凝血酶（MilliporeSigma，T4648）进行重新水化。无细胞的CHIPS使用之前描述的复杂共凝方法制备的FRESH支持浴进行打印（19）。简要来说，FRESH v2.0支持浴（19）是通过在45°C下将3.0%（w/v）明胶B型（Thermo Fisher Scientific，G7-500）、0.3%（w/v）阿拉伯胶（Sigma-Aldrich，G9752）和0.125%（w/v）Pluronic F-127（Sigma-Aldrich，P2443）溶解在50%（v/v）乙醇溶液中制备的。溶解后，立即用1 M盐酸调节溶液的pH至5.65。溶液密封后在室温下搅拌过夜。第二天早上，将浆液以300g的离心力离心2分钟，弃去上清液，换成去离子水并摇匀以清洗颗粒。再将浆液以750g的离心力离心3分钟，弃去上清液并换成去离子水。此清洗步骤重复三次。最后一次清洗后，将浆液重新悬浮至最终浓度100 mM Hepes（pH 7.4）并储存在4°C。打印前，将浆液放入真空室中在室温下放置30分钟，然后以2000g的离心力离心5分钟。弃去上清液，将浆液转移到所选的打印容器中。

CHIPS的设计
CHIPS是在CAD软件（Autodesk Inventor；Autodesk Fusion 360）中创建的。所有模型在打印前都导出为STL文件。总体设计和尺寸根据实验条件和要求有所不同。可渗透的网络被设计为打印CHIPS中的空腔。手稿中使用的所有STL文件都可以在Zenodo仓库中找到（10.5281/zenodo.14975240）。可渗透CHIPS的一般构型如下：整体尺寸为20毫米长×12.50毫米宽×6毫米厚；带刺的切口在长度上中心间距为15.00毫米，在宽度上中心间距为5.50毫米；刺的规格包括针杆直径=1.75毫米、尖端直径=1.60毫米，以及支架顶部到刺尖端的距离=2.273毫米；整个可渗透网络位于CHIPS的中心，顶部和底部各覆盖0.75至1毫米的胶原蛋白。用于手稿制备的3D渲染是在Fusion 360渲染环境中生成的，并导出为PNG文件。组件的组装视频也是在Fusion 360动画环境中制作的，并导出为.avi或.mp4文件。

I型胶原蛋白的FRESH 3D生物打印
I型胶原蛋白的FRESH打印方法如前所述（19）。所有STL文件都使用切片软件（Ultimaker，Cura；PrusaResearch，PrusaSlic3r；Slic3r）切片以生成G-code文件。对于80微米和150微米内径的针头，分别使用了32微米和60微米的层高。CHIPS的打印速度为23至70毫米/秒，具有两个外围层、四个顶部和底部层以及35%的填充率。启用回抽和梳理功能以更好地控制流体流动并减少打印时间。G-code经过优化，以避免过度重叠导致打印段快速移动。所有结构都在室温（22°C）下打印完成。打印完成后，在37°C下孵育至少30分钟以融化支持浴并释放打印物。熔化的支持浴被替换为温热的打印存储溶液（PSS），该溶液由1× PBS、50 mM Hepes（pH 7.4）和1%（v/v）青霉素-链霉素（Life Technologies，15140-122）组成。无细胞的CHIPS可以选择用10分钟的UV臭氧处理进行杀菌，然后在37°C的PSS中过夜孵育以去除残留的明胶。

明场和立体成像
对于所有明场和立体图像，我们使用了配备1× Plan Apo镜头的Leica M165FC显微镜、全可调底座和暗场功能，以及Prime 95B互补金属氧化物半导体（CMOS）相机。此外，打印CHIPS和各种使用的设备的图像也使用配备Laowa 24 mm f/14镜头的Sony A5相机或iPhone 14 Pro拍摄。图像对比度和尺寸调整在FIJI ImageJ或Adobe Photoshop中进行。

CHIPS的OCT成像和3D测量
使用OCT对CHIPS的完整3D结构进行成像，以无创方式评估管道通畅性，用于质量控制和过程中监测（64）。简要来说，OCT图像是使用安装在生物打印机上的Vega 1300 nm OCT系统（Thorlabs，VEG210C1）获得的，该系统配备了OCT-LK4物镜，成像深度为11毫米，横向分辨率为13微米。XYZ体素尺寸分别为16.22微米×16.22微米×8.11微米。扫描完成后，分析3D图像的XY、XZ和YZ平面，以定性评估打印物的通畅性、显著缺陷以及可能影响CHIPS内流体流动的阻塞情况。

从OCT图像中量化可渗透通道直径、纤维直径、填充间距和层直度是在FIJI ImageJ中使用自定义宏完成的。为了在测量通道直径和3D测量分析前提高图像对比度，先对OCT图像进行去噪、背景减除和阈值处理以创建二值图像。然后将图像反转，使通道内部成为明亮信号。使用矩形选择工具为给定的CHIPS选择ROI，复制并重新切片以获得单像素直径表示。接着使用Analyze particles工具对每个通道的ROI进行超过100次测量。由于许多模型的锥形特性，这种量化可能会因为假设通道直径恒定而产生非特异性误差。对于锥形网络，进行了3D测量。

计算3D测量以确定打印CHIPS与原始CAD设计之间的可渗透腔体偏差，使用了FIJI ImageJ、Imaris（Bitplane v9.5）、3D Slicer、3D Builder和Cloud Compare软件的组合。首先，对原始OCT图像进行去噪和缩放，以考虑成像介质的折射率（RI）。处理后的图像导出为TIFF堆栈，并导入Imaris或3D Slicer中进行内部可渗透网络的分割（69）。分割后的内部网络以.STL文件格式导出并导入3D Builder中，以将模型居中于原点。分割的.STL文件和原始用于打印的.STL文件都导入Cloud Compare 3D点云配准软件中。实施标准化流程，将模型对其边界框中心进行对齐并进行精细配准（64, 69）。实现了一个以0为中心的定制LUT，将正偏差（红色，overprint）和负偏差（蓝色，underprint）映射到分割后的.STL模型上。偏差数据以实际模型和CAD模型之间的误差直方图形式显示，颜色编码表示偏差值，以便进一步分析、显示和绘制图表。使用Cloud Compare计算每个模型的RMS误差，基于比较体积内所有点的overprint和underprint偏差结果。

分支血管床CHIPS的手动灌注
通过使用10毫升塑料BD注射器和20号针头从构造物的顶部入口手动灌注浓缩的蓝色食用色素ddH2O溶液来演示分支血管床CHIPS的灌注。调节灌注速率以实现分支网络的填充并从底部出口排出。使用微操作器和辅助装置在不移动打印构造物的情况下稳定灌注过程。灌注时，血管床构造物浸没在50 mM Hepes缓冲液中（pH 7.4）。

VAPOR组装
VAPOR使用CAD软件（Autodesk，Inventor；Autodesk，Fusion 360）设计，并使用Biomed Clear（Formlabs，RS-F2-BMCL-01）树脂在Form 3B（Formlabs，RS-F2-BMCL-01）平台上打印。将不锈钢M3六角螺母（McMaster Carr，94150A325）插入生物反应器主体中的螺母切割眼中。通过移取100微升树脂并将22毫米×22毫米的玻璃盖片（VWR，48366-227）压入盖片中，然后在60°C的UV烤箱中固化以完成密封。使用Cricut Maker从1.5毫米厚的硅胶片（McMaster-Carr，5787 T93）切割定制垫圈，并压入盖片的切割口中。

生物反应器灌注系统组装
使用100毫升玻璃瓶（Cole Parmer，EW-34523-00）作为介质储液器。在瓶盖上钻孔插入管线，插入1/16英寸（1.588毫米）内径的硅胶管（Cole Parmer，EW-95802-02）以确保密封性。另外钻两个孔用于空气过滤和介质交换。将一个使用1.42毫米内径的蠕动泵（Ismatec，EW-95663-34）和相应管路的蠕动泵连接到介质储液器。在泵后放置不可 autoclave的气泡捕捉器（Darwin Microfluidics，LVF-KBT-L-A），并连接1/16英寸（1.588毫米）的带刺适配器（Darwin Microfluidics，CIL-D-646），然后连接到反应器的旋塞上。从反应器的灌注通道和淋巴出口流出的管路返回到介质储液器。

CHIPS的生物反应器灌注
为了无菌操作，3D打印部件在无菌过滤的70%乙醇中超声波处理30分钟，然后在生物安全柜中干燥1小时，并用15分钟的UV臭氧处理进行杀菌。所有剩余部件如蠕动泵管、介质储液器和气泡捕捉器都进行autoclave处理。或者，整个灌注系统可以预先组装并用环氧乙烷进行杀菌以简化工作流程。为了空气过滤，在介质储液器上安装了一个0.2微米孔径的过滤器（VWR，28145-501）。系统在生物安全柜的培养架上组装。所有流动路径用介质冲洗1000微升/分钟，以避免组织中夹杂或灌注空气泡。然后将CHIPS转移到VAPOR腔室中。为了将CHIPS转移到系统中，先将VAPOR的中心孔充满无菌介质或缓冲溶液。芯片随后使用弯曲的金属铲子从打印容器中取出，并转移到中央孔中。宽头镊子也可以用来轻轻夹取和抬起芯片，而细头镊子可能会施加过大的局部压力，从而有损坏结构的风险。接着将芯片移动到适当的位置，使它们的入口和出口对准VAPOR的倒钩。多余的液体被吸出，使芯片缓慢下降到倒钩上，然后施加轻微的向下压力，使芯片的入口和出口与反应器的倒钩紧密结合（图2，Aiii）。密封盖子可以确保在灌注过程中芯片牢固地固定在倒钩上。初次测试时使用恒定的流速100 μl/min，同时进行了可见染料实验、荧光葡聚糖扩散研究以及细胞化芯片的灌注实验。为了验证无泄漏性能，使用了更高的流速1000 μl/min。为了在细胞化灌注过程中保持生理温度，系统被放入37°C的培养箱中。含有血管生物墨水（HUVEC和MSC）的细胞化芯片使用内皮细胞培养基进行灌注，而类似胰腺的芯片则使用50:50比例的内皮细胞培养基和MIN6培养基进行灌注。

接下来是关于CHIPS处理的详细步骤：

1. **芯片的取出与转移**：首先使用弯曲的金属铲子将CHIPS从打印容器中取出，并转移到中央孔中。宽头镊子可以用来轻轻夹取和抬起芯片，而细头镊子可能会造成结构损坏。
2. **芯片的对齐**：然后将芯片移动到适当的位置，使其入口和出口对准VAPOR的倒钩。多余的水分被吸出，使芯片缓慢下降到倒钩上，接着施加轻微的向下压力，使芯片的入口和出口与反应器的倒钩紧密结合。
3. **盖子的密封**：密封盖子可以确保在灌注过程中芯片牢固地固定在倒钩上。
4. **流速的设置**：初次测试使用恒定的流速100 μl/min，后续实验使用更高的流速1000 μl/min进行验证。
5. **温度的调控**：为了在细胞化灌注过程中保持生理温度，系统被放入37°C的培养箱中。
6. **培养基的类型**：含有血管生物墨水的芯片使用内皮细胞培养基进行灌注，而类似胰腺的芯片则使用特定的培养基进行灌注。
7. **染料的灌注**：使用不同的染料（如酚红或pH敏感染料）进行实验，以观察CHIPS的响应。
8. **流路的调节**：通过不同的流路（酸性或碱性溶液）来研究CHIPS在不同条件下的行为。
9. **微粒的灌注**：使用荧光微粒（如FITC标记的葡聚糖）来研究CHIPS的扩散和运输特性。
10. **压力的调节**：通过增加后负荷压力（如5 mmHg）来研究其对扩散的影响。
11. **多材料打印**：使用定制的光学对准系统来精确对齐多个针头，以便进行多材料打印。
12. **免疫荧光染色**：对细胞化芯片进行免疫荧光染色，以观察细胞和生物墨水的分布和相互作用。
13. **组织的透明化处理**：使用特殊的溶液对组织进行透明化处理，以便观察内部结构。
14. **图像分析**：使用先进的软件（如Imaris和NIS Elements）进行图像分析和处理。

这些步骤涵盖了从芯片的制备到实验结果分析的整个过程，确保了实验的准确性和可靠性。在LG Krebs缓冲液中进行预培养期后，接着分别在新鲜的LG Krebs缓冲液和HG Krebs缓冲液中依次孵育1.5小时。GSIS实验重复进行两次。从每个孵育阶段收集的样本被储存在-80°C条件下，以便后续分析胰岛素浓度。使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Mercodia）对每个样本的胰岛素含量进行了分析，每个样本也进行了两次检测。

**统计分析与数据解析**
统计分析使用Prism 10（Graphpad）软件进行，根据实验条件和数据选择了适当的统计方法。对于GSIS实验中胰岛素浓度的比较，采用了非配对t检验。统计显著性标准为P < 0.05，更低的P值表示为P < 0.01。无统计学意义的P值用“ns”表示。图表和视觉效果使用Illustrator版本28.1和Photoshop版本25.3.1（Adobe）制作。补充视频和延时图像在FIJI ImageJ中编辑，并使用Premiere Pro版本24.1（Adobe）进行合并。

**致谢**
我们感谢Feinberg和Shiwarski实验室的成员在完成本研究及手稿编写过程中提供的意见、支持和指导。

**资金支持**
本研究得到了美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（奖项编号：F30HL154728、J.W.T.；K99HL155777、D.J.S.；R00HL155777、D.J.S.；以及5T32HL149648-05、B.D.C.）、Juvenile Diabetes Research Foundation（2-SRA-2021-1024-S-B、A.W.F.）和Additional Ventures Foundation CURES Collaborative（A.W.F.）的资助。

**作者贡献**
- **概念设计与方法制定**：D.J.S.、A.R.H.、J.W.T. 和 A.W.F.
- **方法验证**：D.J.S.、A.R.H.、B.D.C. 和 E.B.
- **实验实施**：D.J.S.、A.R.H.、J.W.T.、E.B.、S.M. 和 B.D.C.
- **资源获取**：D.J.S.、A.R.H.、B.D.C. 和 A.W.F.
- **数据分析**：D.J.S.、A.R.H.、J.W.T. 和 E.B.
- **数据整理**：D.J.S.、A.R.H.、E.B. 和 B.D.C.
- **可视化设计**：D.J.S.、A.R.H. 和 J.W.T.
- **软件与资金申请**：D.J.S. 和 A.R.H.
- **项目管理与监督**：D.J.S. 和 A.W.F.
- **初稿撰写**：D.J.S.、A.R.H.、J.W.T.、E.B.、S.M. 和 A.W.F.
- **审稿与编辑**：D.J.S.、A.R.H.、J.W.T.、E.B.、S.M.、B.D.C. 和 A.W.F.

**利益冲突**
A.R.H.和A.W.F.在FluidFormBio公司任职，A.R.H.、A.W.F.和D.J.S.持有该公司股权；FluidFormBio是一家致力于商业化FRESH 3D打印技术的初创公司。D.J.S.和J.W.T.为FluidFormBio公司提供咨询服务。A.R.H.和A.W.F.是卡内基梅隆大学提交的相关专利的发明人[专利编号US10150258B2，公布日期：2018年11月12日]。D.J.S.、A.R.H.、J.W.T.和A.W.F.还参与了卡内基梅隆大学提交的另一项专利申请[专利编号63/625,061，提交日期：2025年1月21日]。作者声明不存在其他利益冲突。

**数据与材料公开**
论文及补充材料中包含了评估研究结论所需的所有数据。3D生物打印机硬件修改的STL文件、胶原构造物和灌注系统的相关信息可根据开源CC-BY-SA许可在Zenodo.com（链接：10.5281/zenodo.14975240、10.5281/zenodo.7135873）和3dprint.nih.gov/users/awfeinberg获取。更多开源3D模型可在www.ShiwarskiLab.com找到。