利用无死体积流动分流技术开发新型双电化学毛细管电泳检测方法

《Analytical Chemistry》：Development of Novel Dual-Electrochemical Techniques for Capillary Electrophoresis by Means of Dead-Volume Free Flow Splitting

　　

毛细管电泳（CE）与电化学方法（通常以安培检测（AD）形式）的结合，通过提供良好的选择性、稳定性和检测性能而日益重要，尤其是在与非水介质（NACE-AD）联用时。尽管具有这些优势，传统的NACE-AD系统在分析复杂样品时仍面临局限性，例如共迁移分析物的干扰，或需要同时获取氧化和还原信息。已建立的同步氧化和还原检测技术通常依赖于复杂的电极阵列，这些阵列无法提供完全独立的电极过程，同时构成复杂的电化学系统。为解决这些问题，研究人员提出了一种基于无死体积流动分流并结合两个独立AD池的双检测概念（DDC）（CE-AD2），该方法可作为现有方法的用户友好型替代方案，避免大部分上述问题，并为方法开发提供新的机遇。此外，无死体积流动分流还允许将其他破坏性电分析方法与CE-AD结合，例如伏安法。与线性扫描伏安法（LSV）的结合提供了一种多功能工具，可通过分析物特征伏安图进行在线鉴定（定性信息），同时利用AD获取定量信息（CE-AD/LSV）。本研究提出了两种用于NACE的新型电化学DDC，采用新设计的、通过商业流动分流器连接的同步独立AD池。第一种DDC（CE-AD2）在单次测量运行中，利用独立优化的电极（铂用于氧化，银用于还原）和检测电位，同步检测可氧化和可还原物质。第二种方法（CE-AD/LSV）将灵敏的固定电位AD定量分析与LSV在线分析物鉴定相结合。这些系统共同提高了NACE应用中复杂样品监测的灵活性、选择性和分析性能。

论文解读

一、研究背景与问题

毛细管电泳（CE）作为一种高效分离技术，其非水模式（NACE）凭借低电泳电流和良好的长期稳定性受到广泛关注。当NACE与电化学检测结合时，通常以安培检测（AD）形式实现，可获得良好的灵敏度、选择性和稳定性。然而，传统NACE-AD系统在分析复杂样品时面临显著挑战：共迁移分析物难以区分，且单一检测模式难以同时获取氧化和还原信息。虽然已有多种多电极阵列方案被报道用于同步氧化还原检测，但这些阵列构成复杂的电化学系统，氧化和还原过程无法独立优化，且存在氧化还原循环和反馈效应等干扰现象。此外，复杂生物样品中基质效应导致的迁移时间漂移，使得顺序应用不同检测条件变得困难。因此，开发一种能够实现独立、同步氧化还原检测的新型双检测概念（DDC）具有重要的科学意义和应用价值。

二、研究内容与结论

针对上述问题，研究人员提出并验证了两种基于无死体积流动分流的新型DDC。第一种为CE-AD²，通过商业流动分流器连接两个独立的AD池，分别配备铂（Pt）电极用于氧化检测和银（Ag）电极用于还原检测，在单次测量中同步获取氧化和还原信息。第二种为CE-AD/LSV，将固定电位AD与线性扫描伏安法（LSV）结合，在保持AD高灵敏度和稳定性的同时，通过在线伏安图实现分析物的电化学鉴定。

研究以三乙醇胺（TEA）、曲美他嗪（TMZ）、4-硝基氨基苯（NAB）、4,4'-二硝基卡巴尼利（DNC）和2,4-二硝基苯酚（DNP）为模型体系，系统验证了CE-AD²的分析性能。结果表明，该体系具有良好的重现性，各分析物在氧化和还原模式下均可获得稳定的信号响应。检出限（LOD）处于低微摩尔范围，虽然较单一CE-AD有所升高，但仍满足多数分析应用需求。CE-AD/LSV以二茂铁衍生物为模型体系，成功实现了分析物的在线电化学指纹识别，[FcMTMA]⁺和FcMeOH可通过各自特征伏安图被明确区分。该研究发表于《Analytical Chemistry》。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：基于PTFE材料自制的新型AD池设计，采用线性毛细管耦合器实现工作电极与分离毛细管的精确对准；25 μm Pt和Ag盘状微电极的制备与集成；T形流动分流器（LabSmith FS CapTite Interconnect，内径75 μm）实现无死体积的毛细管流分流；双通道BioLogic SP-300恒电位仪在浮动模式下运行，实现两个独立AD池的同步控制和CE接地连接；通过调节检测器间高度差实现两通道迁移时间同步；离线LSV用于模型体系的电化学表征；CE-AD²采用恒电位计时电流模式，CE-AD/LSV则在一个通道持续计时电流检测、另一通道在AD信号出现时触发LSV扫描。

四、研究结果

4.1 双安培检测（氧化/还原）

CE-AD²将独立的同步AD池结合，实现同步氧化和还原检测，同时在电极材料和检测电位的优化方面提供最大自由度。以TEA、TMZ、NAB、DNC和DNP为模型体系，Pt电极用于氧化检测，Ag电极用于还原检测。

4.2 模型体系的电化学表征

通过离线LSV在0.2至1.4 V（氧化）和-0.2至-1.4 V（还原）电位范围内表征了各分析物的电化学活性。经电位补偿后，CE-AD²的检测电位设定为1.2 V（氧化）和-1.2 V（还原）。结果表明TEA、TMZ、NAB和DNP具有氧化活性，TMZ、NAB、DNC和DNP具有还原活性。

4.3 新型双检测概念CE-AD²的分析性能

在400 μM混合样品的CE-AD²测量中，TEA在275 s出现氧化响应，TMZ在302 s同时呈现氧化和还原响应，NAB作为EOF标记物在约400 s出现，DNC在461 s仅呈现还原响应，DNP在515 s同时呈现氧化和还原响应。这种差异化的电化学行为可用于区分共迁移分析物。重现性研究表明，迁移时间、峰高、峰面积和半峰宽（FWHM）均具有良好的标准偏差。LOD测定显示，CE-AD²的LOD较单一CE-AD有所升高，这归因于流动分流导致的迁移时间延长、峰高降低和峰展宽效应。

4.4 安培检测与伏安法结合的电化学指纹识别

CE-AD/LSV以[FcMTMA]⁺和FcMeOH为模型体系，在0.8 V氧化电位下进行连续AD检测，同时在AD信号出现时于另一通道执行LSV扫描。获得的伏安图可明确区分两种分析物。经电位补偿后，在线LSV与离线LSV呈现一致的起始电位和峰电位。采样区域（SR）的建立通过调节LSV扫描速率和CE进样时间实现，本研究采用40 s进样时间和100 mV/s扫描速率。更复杂的TEA、TMZ、NAB和DNP混合体系也成功实现了各组分特征伏安信号的获取。

五、结论

本研究提出了两种完全基于电化学方法的强大DDC。无死体积流动分流和新型用户友好型AD池设计是CE-AD²和CE-AD/LSV的核心要素。CE-AD²在方法开发中提供高度灵活性（电极材料和检测电位的自由选择），同时通过同步氧化还原检测实现电化学指纹图谱分析，并可在不同检测条件下区分共迁移物质。CE-AD/LSV通过特征伏安图增强了对电泳图中各化合物的鉴定能力。这些结果展示了AD和伏安法与NACE结合在独立AD池DDC中的潜力，为需要高分离效率、低样品消耗、成本效益和适应性的复杂样品常规分析提供了多种选择。由于装置的模块化特性和AD池的适应性，NACE中获得的结果也可轻松转化为使用合适电极材料的水相CE体系。此外，模块化设计还便于实现其他安培和伏安技术，如脉冲方法，以构建更多基于电化学的DDC。