综述：一种高耐逆海洋酵母——Scheffersomyces spartinae W9作为多机制生防制剂防治草莓灰霉病的研究

《Biological Control》：A highly stress-tolerant marine yeast, Scheffersomyces spartinae W9, as a multi-mechanistic biocontrol agent against Botrytis cinerea on strawberry

　　

一种高耐逆海洋酵母 Scheffersomyces spartinae W9作为多机制生防制剂防治草莓灰霉病的研究 摘要：草莓（Fragaria × ananassa Duch.）因其诱人的色泽、质地、风味和营养价值而深受全球消费者喜爱。然而，其生产和采后货架期受到由Botrytis cinerea引起的灰霉病的严重威胁，导致重大经济损失。虽然合成杀菌剂仍是病害防控的主要策略，但其持续使用引发了关于环境可持续性、人类健康风险以及病原菌抗药性产生的日益关注。因此，开发有效且可持续的方法迫在眉睫。利用拮抗微生物（尤其是酵母）进行生物防治，是管理采后病害的一种有前景的策略。然而，这些酵母在商业化应用中的一个关键挑战是，在采前生产及采后贮藏与流通过程中遇到的严苛多变条件下，其生防活性常会下降。营养限制、温度极端变化和氧化胁迫等因素均可能损害酵母的活力和拮抗功能。因此，优异的耐逆性是候选生防酵母的关键理想性状。在此背景下，源自海洋环境的酵母引起了越来越多的兴趣。海洋酵母适应了高盐度、寡营养和温度波动的条件，具有先天韧性，这可能增强其在果实表面的存活和表现。Scheffersomyces spartinae是一种常见于海洋生境的酵母。先前研究表明其具有对盐胁迫和宽泛pH范围的耐受性，以及对某些细菌和真菌的抗菌活性。在研究人员的初步工作中，研究人员报道了 S. spartinae 防治草莓灰霉病的生防潜力，并确定了挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）是其抗真菌机制之一。然而，对其环境胁迫耐受性、安全性以及在果实表面直接酵母-病原互作过程中的作用机制尚未进行系统评估。本研究特别聚焦于这些直接接触机制——包括生物膜形成、在伤口部位的快速定殖与增殖、胞外水解酶的产生以及与病原菌菌丝的黏附，而不涉及VOCs（这是研究人员先前研究的主题）。因此，本研究旨在：（1）从海洋沉积物中分离并分类鉴定一株拮抗酵母；（2）对该分离株进行初步安全性评估；（3）表征其对关键环境胁迫的耐受性；（4）探究其在酵母-病原-果实直接互作过程中抑制草莓灰霉病的机制。

2. 材料与方法

2.1 病原菌

B. cinerea 菌株ACCC 36028购自中国农业微生物菌种保藏中心，以甘油冻存管保存于-80°C。活化时，将菌种划线接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA），于25°C培养5天。此过程重复两个连续周期后进行实验。孢子悬浮液通过用无菌蒸馏水冲洗10日龄的 B. cinerea 培养物制备，随后经两层无菌300目尼龙布过滤以去除菌丝碎片。最终孢子悬浮液使用血球计数板进行定量调整。

2.2 果实样品

草莓（Fragaria ananassa Duch. cv. Hongyan）购自当地温室。选择成熟度、大小和颜色均匀、无可见缺陷或病害的果实。其成熟度特征为可溶性固形物含量11.8 ± 0.8%，硬度15.0 ± 5.2 N（使用质构仪测定）。使用前，果实经75%乙醇表面消毒并风干。

2.3 S. spartinae W9的分离、鉴定与形态学特征

酵母菌株最初分离自南海某热带岛屿潮间带沉积物，基于内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）进行分类鉴定。系统发育分析使用MEGA 7软件进行。形态学观察时，酵母在营养酵母葡萄糖琼脂培养基（nutrient yeast dextrose agar，NYDA）上于28°C培养48小时，使用光学显微镜观察细胞形态。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）分析时，酵母先在营养酵母葡萄糖肉汤（nutrient yeast dextrose broth，NYDB）中于28°C、180 rpm振荡培养48小时，收集细胞并按标准方案制备用于SEM观察。

2.4 S. spartinae W9的安全性评价

通过将细胞悬浮液与保护剂混合后冷冻干燥制备酵母冻干粉，最终浓度为4.2 × 10⁸ CFU g^-1。急性经口毒性试验委托浙江长三角化学安全评价有限公司进行。采用限量法，剂量为5000 mg kg^-1。选用SPF级SD大鼠（雌雄各5只，8-10周龄），适应性饲养5天后，禁食过夜，按体重单次经口灌胃给药。连续观察14天，记录毒性反应、症状发生与恢复情况及死亡率，并在第0、7、14天称重。之后处死存活大鼠进行大体解剖检查；有病变的组织进行切片镜检。计算半数致死剂量（median lethal dose，LD₅₀）并根据标准进行毒性分级。

2.5 S. spartinae W9对逆境环境的耐受性

2.5.1 对盐、pH、温度和氧化胁迫的耐受性

将酵母悬浮液接种至含有特定胁迫因子的NYDB培养基中：NaCl终浓度分别为0（对照）、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0%（w/v）用于盐胁迫；pH值分别调至2.5、4.0、5.5、7.0（对照）、8.5和10.0用于pH胁迫；热胁迫处理时，将酵母悬浮液分别在25（对照）、40、45、50、55、60或65°C水浴中孵育30分钟；氧化胁迫时，酵母细胞暴露于0（对照）、5、10、20或100 mM H₂O₂中30分钟。所有培养物于28°C、180 rpm振荡培养24小时后，读取600 nm处的光密度值（OD₆₀₀），计算相对生物量。

2.5.2 对紫外线（ultraviolet，UV）胁迫的耐受性

制备不同浓度的酵母悬浮液，取5 μL点样于NYDA平板上。平板置于超净工作台中，用30 W紫外灯（λ = 254 nm）在距离20 cm处照射，通过控制暴露时间（0、5、15和25分钟）调节辐照剂量。照射后立即将平板倒置，在25°C黑暗条件下培养48小时，观察并拍照记录酵母生长情况。

2.6 S. spartinae W9防治草莓灰霉病的效力

在草莓赤道面制造伤口，风干后接种10 μL酵母悬浮液，对照接种等量无菌蒸馏水。2小时后，再接种10 μL B. cinerea 孢子悬浮液。处理后的草莓置于通风保鲜盒中，在25°C、90%相对湿度条件下培养4天。每天测量病斑直径并计算发病率。

2.7 S. spartinae W9体外和体内抑制 B. cinerea 孢子萌发的评估

2.7.1 体外试验

将 B. cinerea 孢子与等体积的酵母悬浮液或无菌水混合于PDB中。在25°C、120 rpm振荡培养19小时后，显微镜下观察孢子萌发情况。以芽管长度超过孢子直径一半视为萌发，计算孢子萌发率。

2.7.2 体内试验

按效力试验方法处理果实。在贮藏0、12、24和48小时，迅速切取伤口部位组织，用3%戊二醛固定，按前述方案制备样品进行SEM观察。

2.8 S. spartinae W9在草莓果实表面和伤口中的生长动态

2.8.1 果实表面

将草莓果实浸入酵母悬浮液中30秒，风干后分别贮藏在20°C或4°C、90%相对湿度条件下。定期取样，将果实浸泡于无菌蒸馏水中振荡洗涤，洗涤液经梯度稀释后涂布于含链霉素的NYDA平板上，28°C培养48小时后计数酵母菌落，结果表示为log₁₀ CFU/100 g鲜果重。

2.8.2 果实伤口

在草莓赤道面制造伤口，接种10 μL酵母悬浮液，风干后于20°C或4°C、90%相对湿度条件下贮藏。定期取样，切取伤口周围组织，匀浆后梯度稀释，涂布于含链霉素的NYDA平板上，28°C培养48小时后计数，结果表示为log₁₀ CFU/伤口。

2.9 S. spartinae W9的生物膜形成能力

采用结晶紫染色法评估酵母的生物膜形成能力。将酵母悬浮液加入96孔细胞培养板中，以无菌蒸馏水为空白对照，加入YNB培养基，密封后于28°C分别培养24、48、72和96小时。培养结束后，弃去培养液，洗涤、固定、干燥，然后用0.3%结晶紫染色20分钟。洗去多余染料并干燥后，加入33%冰醋酸，使用酶标仪记录590 nm处的光密度值（OD₅₉₀）。根据OD值将生物膜形成能力分为无、弱、中和强四个等级。

2.10 S. spartinae W9的胞外水解酶产生能力

测定了 S. spartinae W9分泌几丁质酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）、蛋白酶和纤维素酶这四种胞外水解酶的能力。将酵母悬浮液点样于分别含有胶体几丁质、海带多糖、脱脂牛奶和羧甲基纤维素钠的鉴别培养基上，28°C培养5天。观察菌落周围是否出现透明水解圈，以此判断酶的产生。Saccharomycopsis strictum 作为产酶验证的阳性对照菌株。

2.11 S. spartinae W9对 B. cinerea 的黏附能力

将无菌盖玻片浸入液态PDA培养基中凝固，然后在上面涂布 B. cinerea 孢子悬浮液，25°C培养32小时。随后滴加酵母悬浮液，继续共培养48小时。以无菌蒸馏水代替酵母悬浮液作为对照。共培养结束后，用无菌水冲洗盖玻片5分钟，在光学显微镜下观察 B. cinerea 菌丝与 S. spartinae W9之间的相互作用。

2.12 统计分析

数据以平均值±标准差表示。使用SPSS 22.0软件，通过单因素方差分析（ANOVA，后续采用Duncan检验进行多重比较）或独立样本t检验（用于两组比较）确定显著性差异，P < 0.05视为显著。图表使用Origin 9.0绘制。

3. 结果

3.1 S. spartinae W9的分子鉴定与形态学特征

通过对27株初筛菌株的ITS区进行PCR扩增、测序和NCBI BLAST分析，系统发育分析确认菌株W9属于 S. spartinae。在NYDA培养基上培养48小时后， S. spartinae W9形成直径1-3 mm的圆形菌落，呈乳白色、凸起、表面光滑、边缘规则，无异源色素产生，带有独特气味。细胞形态呈球形或椭圆形，通过单极或多极出芽繁殖。

3.2 急性经口毒性试验

对大鼠经口灌胃 S. spartinae W9冻干粉后，14天内未观察到死亡，死亡率为0%。大鼠体重稳步增长，活动正常，无异常行为，大体解剖未见异常。该酵母冻干粉对雌性和雄性大鼠的LD₅₀均 > 5000 mg/kg。根据食品急性毒性剂量分级标准，该酵母被归类为实际无毒级。

3.3 S. spartinae W9的耐逆性

随着NaCl浓度升高， S. spartinae W9的生物量逐渐降低。在6.0%、8.0%和10.0% NaCl浓度下，相对生物量分别为63.7%、6.8%和0.7%，表明其具有一定的耐盐性，可归类为耐盐酵母。该酵母能在pH 2.5至10的范围内生长。在pH 4至8.5范围内，相对生长量超过93.0%；在pH 2.5时为63.6%；而在pH 10.0时仅为3.3%，表明其能在宽泛pH范围生长，且在酸性条件下生长最佳。热处理显著影响其生长。40°C时相对生物量降至46.4%，45-55°C时降至0.5%以下，但在60°C处理后仍维持3.0%的低水平相对生长率，表明30分钟的60°C处理不足以完全灭活该酵母，显示出显著的耐热性。随着H₂O₂浓度增加，相对生长量下降。在0、5、10、20和100 mM H₂O₂浓度下，相对生物量分别为100.0%、91.4%、62.1%、12.3%和0.2%，表明其具有一定氧化胁迫耐受性。与对照组相比，随着UV照射时间延长，菌落数量减少。即使在25分钟UV照射后，接种浓度为1 × 10⁵ cells mL^-1的处理组中仍有少量酵母细胞存活，表明其具有较强的UV抗性。

3.4 S. spartinae W9抑制草莓灰霉病

与对照组相比， S. spartinae W9处理显著降低了草莓灰霉病的发病率和病斑直径。具体而言，第3天的发病率为55.4%，较对照组降低了44.6%。同时，第4天酵母处理组的病斑直径为10.8 mm，较对照组减少了53.2%。这表明 S. spartinae W9能有效抑制草莓灰霉病。

3.5 S. spartinae W9体外和体内对孢子萌发的抑制作用

与对照组相比， S. spartinae W9将孢子萌发率显著抑制至30.7%，降幅达60.6%，表明其具有显著的体外抑制 B. cinerea 孢子萌发的能力。体内SEM观察显示， S. spartinae W9在草莓果实伤口部位快速增殖，48小时时可见大量酵母细胞。单独接种 B. cinerea 的组中，12小时开始萌发，24小时可见大量菌丝生长，48小时形成密集菌丝网络。而在共接种组中，24小时仅见短菌丝，48小时仍观察到大量未萌发的孢子。结果表明 S. spartinae W9能有效抑制 B. cinerea 孢子在草莓果实上的萌发及随后的菌丝发育。

3.6 S. spartinae W9在草莓果实表面和伤口中的生长动态

S. spartinae W9在不同贮藏温度下的种群动态存在显著差异。在果实表面，20°C时酵母数量在72小时内显著增加，从1.35 × 10⁷增至4.12 × 10⁷ CFU/100 g（增加3.0倍）；在4°C时，生长较慢，第9天从1.02 × 10⁷增至1.74 × 10⁷ CFU/100 g（增加1.7倍），并维持至第15天。在伤口中，20°C时酵母在48小时内快速增殖，从1.06 × 10⁵增至3.41 × 10⁶ CFU/伤口（增加32.3倍）；而在4°C时，种群在15天内保持稳定，无明显变化。结果表明， S. spartinae W9能在常温下快速定殖和增殖于草莓果实表面和伤口，而在长期冷藏期间生长微弱，种群基本保持稳定。

3.7 S. spartinae W9的生物膜形成能力

S. spartinae W9的OD₅₉₀值随时间增加直至达到平台期，在72小时达到峰值1.16 ± 0.22。在所有检测的时间点（24、48、72和96小时），OD₅₉₀值均超过4 × ODc，证明其具有强大的生物膜形成能力。

3.8 S. spartinae W9的黏附和水解酶活性

在水解酶检测中，仅在β-1,3-葡聚糖酶（GLU）鉴别培养基上观察到微弱的透明水解圈，而在几丁质酶（CHI）、蛋白酶和纤维素酶鉴别培养基上均未检测到水解圈。这表明 S. spartinae W9具有β-1,3-葡聚糖酶活性，但在测试条件下无可检测到的几丁质酶、蛋白酶或纤维素酶活性。共培养48小时后， S. spartinae W9细胞密集附着在 B. cinerea 菌丝上。即使经过5分钟无菌水冲洗，仍有少量酵母细胞黏附在菌丝上。然而，共培养后未观察到明显的菌丝细胞壁降解、裂解或穿透现象，表明典型的真菌寄生事件在测试条件下并非主要作用方式。

4. 讨论

综合本研究结果与前期研究，提出了 S. spartinae W9抑制草莓灰霉病的多机制模型。凭借其内在的环境胁迫耐受性，该酵母可能通过快速增殖和生物膜形成在果实表面定殖和持久存在，从而与入侵的 B. cinerea 竞争营养和空间。同时，其释放的VOCs直接抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长。在这些机制中，有效的定殖/生物膜形成和VOC介导的直接抑制可能是其生防效力的主导因素。

5. 结论

本研究系统地探究了海洋酵母 S. spartinae W9对草莓采后灰霉病的生防性能，并提出了一个多机制模型。其强大的环境适应性、定殖能力、生物膜形成能力，以及课题组先前报道的VOC介导的活性，共同表明多种机制可能促成了 S. spartinae W9的生防效力。这些发现为开发基于海洋酵母的新型生防制剂提供了理论基础和微生物资源。