基于非线性电泳的自由溶液微流控颗粒与细胞分离

《Analytical Chemistry》：Free Solution Microfluidic Separations of Particles and Cells with Nonlinear Electrophoresis

　　

绝缘体基电动力学（insulator-based electrokinetic, iEK）平台在微通道内集成绝缘结构，以放大非线性电泳（nonlinear electrophoresis, EPNL）效应并提高分离效率，此类效应随电场强度增大而增强，并引入更具判别性的特征。相比之下，用于传统毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）系统的自由溶液平台传统上忽略EPNL效应，仅依赖目标分析物的电荷，通过线性电泳（linear electrophoresis, EPL）进行分离。本研究通过分离二元微颗粒混合物以及电荷相同的二元微颗粒与蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）混合物，测试了自由溶液平台中的EPNL效应。尽管分析技术通常在“优质”（高分辨率）与“快速”（短时长）之间面临权衡，结果表明EPNL可同时实现两方面优势。利用EPNL使分离分辨率（Rs）提高多达50%，同时使分离时长缩短56%，与仅依赖EPL的平台相比，EPNL分离既更快又更优。此外，当EPNL效应增强时，微颗粒与细胞二元混合物的分离分辨率达到>2.0，远高于1.5的金标准。据研究人员所知，该工作首次报道了EPNL在自由溶液中的如此全面优势，有效克服了传统开放通道电动分离的性能权衡。

**自由溶液微流控平台中非线性电泳分离颗粒与细胞的研究解读**

**一、研究背景**

电泳（electrophoresis, EP）是分离大分子、微生物及其他带电物种的重要技术手段。Tiselius最早以“移动边界电泳”之名发展了自由溶液毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）方法，其原理在于电渗（electroosmosis, EO）与电泳的联合作用下，带电分析物因电荷差异产生差异化迁移速率。随后，众多研究报道了CE用于完整微生物的鉴定、表征与分离。然而，传统CE仅依赖线性电泳（linear electrophoresis, EPL）作为区分性电动（electrokinetic, EK）现象，在分离性能上长期面临“高分辨率”与“短时长”难以兼得的权衡。尺寸分离通常依赖筛分基质，如毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE），或采用介电电泳（dielectrophoresis, DEP）等替代方案。绝缘体基电动力学（insulator-based electrokinetic, iEK）平台通过在微通道内集成绝缘结构来放大非线性电泳（nonlinear electrophoresis, EPNL）效应，并已被证明可切换分离机制，但以往研究未曾将EPNL应用于无绝缘结构的自由溶液平台。本研究首次在自由溶液微流控平台中利用EPNL分离微颗粒与细菌细胞，旨在同时提升分离分辨率并缩短分离时长，相关工作发表在《Analytical Chemistry》。

**二、主要技术方法**

研究人员采用标准软光刻技术制备深度为40 μm的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）矩形及T形微流控器件，以0.2 mM K₂HPO₄（含0.05% v/v Tween 20）为悬浮介质。样本队列包括三种聚苯乙烯微颗粒（Particle 1：羧基化、绿色、直径10.4 μm；Particle 2：硫酸化、红色、直径4.0 μm；Particle 3：羧基化、红色、直径7.0 μm）及蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus, B. cereus, ATCC 14579）。通过粒子示踪测速（particle tracking velocimetry, PTV）实验构建颗粒/细胞速度-电场（U_P,e vs E）曲线，测定ζ电位（ζ_P）并量化EPNL效应强度（ΔM_EP^RMS）。借助COMSOL Multiphysics数值模型求解T形器件分离通道中的电场分布，据此设计线性（EPL主导）与非线性（EPNL主导）电泳分离实验。分离过程由荧光显微镜记录，采用自编Python脚本分析电泳图谱并计算分离分辨率（Rs）与总分离时长（τ）。

**三、研究结果**

**（一）微颗粒与B. cereus细胞的电动特征**

PTV实验表明，所有样本的U_P,e随E增大呈凹形偏离EO+EPL线性模型，证实EPNL效应随电场增强而显著。B. cereus的ΔM_EP^RMS值最高（1.37 (μm/s)/(V/cm)），其次为Particle 2（0.34），Particle 1（0.24）与Particle 3（0.14）较低。ζ_P测定值分别为：Particle 1为?11.2 ± 1.3 mV，Particle 2为?44.2 ± 2.5 mV，Particle 3为?34.5 ± 1.9 mV，B. cereus为?34.9 ± 2.5 mV。

**（二）分离系统1：Particle 1与Particle 2**

线性分离结果：在E=105 V/cm条件下，Particle 1与Particle 2的保留时间（t_R,e）约为76 s与181 s，Δt_R,e约105 s，Rs=2.2，τ约252 s。线性分离保留时间预测比较：Smoluchowski近似模型（t_R,p^EPL）对Particle 1产生?19%的误差（PE），二次拟合模型（t_R,p^fit）产生?14%的PE；对Particle 2则分别产生2%和29%的PE。非线性分离结果：在E=377 V/cm条件下，两者t_R,e降至约27 s与74 s，Δt_R,e约47 s，Rs升至4.2，τ降至约110 s，线性与非线性分离的Rs范围分别为2.2–2.7与3.6–4.2，非线性分离使Rs提高29%、τ缩短56%。非线性分离保留时间预测比较：t_R,p^EPL对两颗粒的PE分别为?30%与?33%，t_R,p^fit分别为?22%与20%，表明仅考虑EPL的预测在非线性条件下误差增大，而二次拟合预测更优。未解释现象来源：部分预测偏差归因于分离过程中颗粒间的相互作用，包括DEP力及浓度极化引起的静电力，Particle 2因尺寸最小（4.0 μm）最易受影响；稀释实验证实0.2% v/v的样本浓度无显著影响。

**（三）分离系统2：Particle 3与B. cereus细胞**

该二元混合物中两种样本ζ_P几乎相同（差异<0.5 mV），在EPL框架下无法实现有效分离。线性分离结果：在E=75 V/cm条件下，Particle 3与B. cereus的t_R,e约为184 s与240 s，Δt_R,e约56 s，Rs=0.8，两峰重叠，τ约350 s。线性分离保留时间预测比较：t_R,p^EPL对Particle 3和B. cereus的PE分别为?5%与?33%，t_R,p^fit分别为2%与?3%，其中B. cereus在中等场强下即显著偏离Smoluchowski近似。非线性分离结果：在E=240 V/cm条件下，两者t_R,e降至约59 s与176 s，Δt_R,e增至约117 s，Rs达2.3，实现完全分离，τ约325 s，线性与非线性分离的Rs范围分别为0.8–1.2与2.0–2.3，非线性分离使Rs提高50%，同时τ略有缩短。非线性分离保留时间预测比较：t_R,p^EPL的PE分别为?13%与?78%，t_R,p^fit均为?3%，B. cereus的线性模型PE绝对值超过50%，凸显EPNL对其迁移的主导作用。B. cereus细胞上EPNL的强度：B. cereus呈杆状非球形，其EPNL效应最强，与非球形分析物EPNL增强的理论预期一致。

**四、讨论与结论**

研究表明，EPNL在自由溶液平台中可同时提高分离分辨率并缩短分离时长，克服了传统开放通道电动分离中“高分辨率”与“快速”之间的性能权衡。二次经验拟合模型对保留时间的预测优于Smoluchowski近似，证明EPNL在电场超过中等强度时发挥重要作用。本工作首次实验证明EPNL无需绝缘结构即可实现高质量分离；在样本电荷几乎相同（ζ_P差异<0.5 mV）的二元混合物中，EPNL是获得完全分离（Rs>1.5）的唯一可行方案。未来需构建更完善的模型以预测超越中等场强的EPNL行为，并进一步考虑颗粒间相互作用对迁移的影响。这些发现表明，非线性电泳分离在分辨率和时长两项关键指标上均优于线性电泳分离。