人工智能引导发现一种在阿尔茨海默病小胶质细胞模型和 5xFAD 模型中有效的脑穿透性 LILRB4 抑制剂

《Bioorganic Chemistry》：AI-guided discovery of a brain-penetrant LILRB4 inhibitor active in microglial and 5xFAD models of Alzheimer's disease

　　抑制性微胶质细胞受体LILRB4（ILT3）通过ApoE依赖性信号通路抑制阿尔茨海默病（AD）中的淀粉样β（Aβ）清除。在此，我们报道了一种独立的、由人工智能引导的小分子抑制剂发现方法，用于抑制LILRB4-ApoE相互作用。对约5亿个化合物进行超大规模筛选，识别出化学结构迥异的分子，这些分子以纳摩尔亲和力结合LILRB4并抑制ApoE的参与，已通过正交的生物物理和生化实验进行了验证。结构建模和突变分析确定了跨结构域口袋及与配体识别相关的关键残基。在人类诱导多能干细胞来源的微胶质细胞中，化合物4减少了SHP1/2的磷酸化，减弱了NF-κB的激活和IL-1β的分泌，并在不影响细胞活力的前提下恢复了Aβ的摄取。该化合物表现出口服生物利用度和脑渗透性。在雄性和雌性5xFAD小鼠中，每日一次口服给药改善了Y迷宫表现，并降低了区域性Aβ42水平、炎症性细胞因子和CD86阳性微胶质细胞。这些发现确立了基于检索的人工智能作为LILRB4配体发现的补充途径，并鉴定出化合物4作为具有药理学差异化的候选药物，供进一步优化。**摘要**阿尔茨海默病（AD）仍然是一项重大的未满足临床需求，疾病修饰疗法在很大程度上局限于针对淀粉样的抗体，这些抗体提供的益处有限，并受限于有限的脑渗透性和安全性方面的担忧[1], [2], [3], [4], [5]。越来越多的证据表明微胶质细胞是淀粉样β（Aβ）病理的关键调节因子，其中疾病进展反映了控制微胶质细胞功能的激活信号通路和抑制信号通路之间的失衡[2], [6], [7], [8], [9], [10]。微胶质细胞的反应由激活受体（如髓系细胞触发性受体2（TREM2））与抑制性受体（包括CD33和白细胞免疫球蛋白样受体（LILR）家族的成员）之间的平衡所调节，这些受体共同塑造吞噬能力和炎症信号[4], [5]。包括我们自己的研究在内的近期研究表明，靶向TREM2的小分子可以重新编程微胶质细胞功能，支持了对神经免疫检查点进行药理学调控的可行性[11], [12], [13], [14]。抑制性受体白细胞免疫球蛋白样受体B4（LILRB4，ILT3）最近被发现是一个关键的微胶质细胞免疫检查点，它通过ApoE依赖性信号抑制Aβ的清除[15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]。LILRB4在AD患者的微胶质细胞中高度上调，尤其是在斑块相关群体中，其表达水平与ApoE水平以及包括磷酸化tau在内的病理标志物相关（23）。从机制上看，LILRB4的激活会启动免疫受体酪氨酸激活抑制基序（ITIMs），招募SHP1/2磷酸酶，并抑制细胞骨架重塑和吞噬途径，这些途径对于有效的斑块清除是必需的。在临床前模型中，抗体介导的LILRB4阻断恢复了微胶质细胞的激活，增强了Aβ的吞噬，并减少约50%的淀粉样斑块负荷，同时伴随着干扰素反应程序的抑制和斑块相关微胶质细胞的重组织（23）。这些发现将LILRB4确立为AD一个极具吸引力的治疗靶点，并鉴定出LILRB4-ApoE相互作用作为一个功能定义明确的界面，适合进行药理学靶向。人工智能（AI）的最新进展正在改变基于结构的药物发现，尤其是对于那些缺乏明确结合口袋的棘手靶点[24], [25], [26], [27], [28], [29], [30]。与蛋白质-蛋白质相互作用相关的AI方法包括复合体预测模型，如AlphaFold-Multimer、AlphaFold 3和RoseTTAFold All-Atom，以及基于表面的界面预测器，包括MaSIF和PeSTo[31], [32], [33]。这些方法对于定义推测的相互作用几何结构或识别可能的蛋白质相互作用表面具有价值，但它们并非旨在在超大规模化学库中筛选小分子。相比之下，DrugCLIP（28）使用对比学习将蛋白质口袋和小分子的表征对齐到共享的嵌入空间中，实现密集检索而非传统的亲和力预测。这种策略能够快速筛选候选配体针对预定义的结合位点，非常适合蛋白质-蛋白质相互作用表面附近的化学可处理口袋。我们之前的研究通过DNA编码化合物库筛选和亲和力选择-质谱法鉴定了化学结构迥异的LILRB4抑制剂，实验上确立了LILRB4作为一个可成药的神经免疫检查点[34], [35]。在此，我们应用DrugCLIP鉴定出化合物4作为ApoE-LILRB4轴的独立的、可穿透血脑屏障的抑制剂。选择DrugCLIP是因为本研究的目标是针对已定义的LILRB4跨结构域口袋检索小分子，而非预测LILRB4-ApoE复合体的结构，该结构目前仍未解析。随后通过对接、生物物理验证、突变分析和在人类微胶质细胞及5xFAD小鼠中的功能测试对候选配体进行了评估。这项工作共同凸显了基于检索的AI筛选作为识别神经免疫受体小分子调节剂的补充方法。**章节摘要****鉴定LILRB4上可用于AI引导筛选的可配体化表面**为了评估LILRB4的小分子调节潜力，我们首先寻求鉴定其胞外结构域上可结合配体的区域。利用PrankWeb（36）对人LILRB4胞外结构域（PDB ID：3P2T）进行结构分析，揭示了一个位于D1-D2跨结构域界面的单一、明确定义的表面口袋（图1A）。该区域形成了一个连续的、溶剂可及的空腔，富含疏水性和极性残基，包括Leu132、Lys134、Leu144、Pro158、Met159、Val165等，**AI引导的LILRB4靶向小分子筛选**人LILRB4的胞外区域根据已沉积的晶体结构（PDB 3P2T）进行建模。在口袋分析之前，使用AMBER ff14SB力场对坐标进行松弛，以纠正不利的接触，同时不实质性地改变蛋白质骨架。随后使用PrankWeb 4（36）绘制候选小分子位点。得分最高的位点是D1-D2连接处的一个可及凹槽；其排名、溶剂暴露性以及其靠近此前与LILRB4相关的区域，**CRediT作者贡献声明****Somaya A. Abdel-Rahman：** 撰写——初稿、方法论、调查研究、数据管理。**Moustafa T. Gabr：** 撰写——审阅与编辑、指导、方法论、调查研究、概念化。**利益冲突声明**作者声明，他们不存在已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能影响本论文中所报告的工作。Somaya A. Abdel-Rahman | Moustafa T. Gabr哥伦比亚大学欧文医学中心放射学系，美国纽约市纽约州10032