毒性之制动：铁抑制巨噬细胞中有机物诱导的超氧阴离子产生

《Environmental Science & Technology》：A Brake on Toxicity: Iron Suppresses Organic-Induced Superoxide Generation in Macrophages

　　

铁(Fe)是刹车磨损颗粒(BWPs)和城市颗粒物中的主要金属，但其在调节氧化应激毒性中的作用仍知之甚少。研究人员发现，低剂量（<10 μg mL^–1）的BWPs诱导少量细胞超氧阴离子(•O₂^–)产生，但较高剂量下则以剂量依赖方式抑制其产生。相比之下，公路PM_2.5既不显著诱导也不抑制细胞•O₂^–的生成。研究人员使用单独Fe或与异戊二烯二次有机气溶胶或9,10-菲醌（典型的有机化合物，已知通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活诱导细胞•O₂^–）混合，证明Fe²⁺和Fe³⁺均以剂量依赖方式主动抑制基线和有机物诱导的•O₂^–。通过抑制实验和qRT-PCR分析，研究人员提出Fe抑制细胞•O₂^–的机制如下：外源性Fe补充细胞内不稳定铁池或与有机物复合。这缓解了有机物诱导的铁缺乏，降低了NADPH氧化酶活性，从而减少了•O₂^–的释放。同时，Fe通过直接化学反应消耗•O₂^–。这项工作揭示了铁在巨噬细胞中是有机物诱导•O₂^–产生的抑制剂而非促进剂，其作用机制是通过恢复铁稳态和直接化学淬灭。这些发现强调了在评估复杂环境混合物健康影响时同时考虑金属和有机成分的重要性。

**铁对巨噬细胞超氧阴离子生成的抑制作用——从促氧化到调控因子的范式更新**

流行病学研究表明，暴露于环境颗粒物（PM）与呼吸系统和心血管系统的不良结局密切相关，而氧化应激被视为颗粒物毒性的核心机制之一。铁（Fe）是刹车磨损颗粒（BWPs）和城市颗粒物中含量最高的金属，但其在调节氧化应激毒性中的角色始终存在争议。传统观点认为，Fe通过Fenton化学和Haber-Weiss反应产生高活性的羟基自由基（•OH），发挥促氧化作用；但Fe同时也是必需营养素，其细胞内水平受复杂的铁稳态网络调控，铁缺乏可损害细胞功能。已有研究矛盾地显示，含铁纳米颗粒可降低细胞内活性氧，而部分BWP暴露并未诱导细胞ROS升高。这一矛盾凸显出关键研究空白：Fe作为富铁BWPs和交通相关PM的主要金属，究竟是促进还是抑制细胞ROS产生，其机制如何？为了回答这一问题，研究人员系统地研究了Fe对巨噬细胞中超氧阴离子（•O₂^–）产生的调节作用。

研究人员首先在RAW264.7巨噬细胞中观察了实验室生成的BWPs和公路PM_2.5暴露后的细胞•O₂^–响应，随后使用Fe²⁺、Fe³⁺与典型有机化合物（9,10-菲醌PQN和异戊二烯二次有机气溶胶SOA）单独或联合暴露，结合抑制实验和基因表达分析，阐明了Fe抑制•O₂^–的机制。研究发现，Fe并非以往认为的ROS促进剂，而是有机物诱导的•O₂^–产生的抑制剂，其作用通过恢复铁稳态和直接化学淬灭实现。这一发现挑战了“铁仅作为促氧化剂”的传统观点，强调了在评估复杂环境混合物健康影响时金属-有机物相互作用的重要性。该成果发表在《Environmental Science》上。

本研究采用了多种关键技术方法。BWP样本由加州大学欧文分校自制制动测功机生成，公路PM_2.5于2023年5月在美国加州I-710高速公路旁采集，异戊二烯SOA由PAM氧化流反应器（PAM-OFR）生成。细胞实验使用RAW264.7小鼠巨噬细胞系（ATCC TIB-71）。细胞•O₂^–产生速率通过Diogenes化学发光系统结合电子顺磁共振（EPR）谱定量，并使用超氧化物歧化酶（SOD）验证信号特异性。NADPH氧化酶抑制实验采用apocynin。基因表达分析采用实时定量反转录PCR（qRT-PCR），检测SOD1、TFRC、NOX2和FTH1等基因。细胞毒性通过CellTox Green法监测。

**结果与讨论**

**1. 刹车磨损颗粒和公路PM_2.5诱导的细胞•O₂^–生成**
测量结果显示，陶瓷BWPs在低于10 μg mL^–1剂量时轻微诱导细胞•O₂^–，高于该剂量则呈剂量依赖性抑制；半金属BWPs在低剂量下无显著诱导，但高剂量趋势与陶瓷BWP类似。公路PM_2.5在整个测试剂量范围内（约10–100 μg mL^–1）既无显著诱导也无明显抑制。细胞毒性实验证实，•O₂^–的下降并非细胞死亡所致。这一结果与部分既往研究一致，也解释了不同BWP研究间结果差异可能源于铁和有机物含量比例的竞争。

**2. Fe单独及与有机物联合暴露的细胞•O₂^–生成**
单独暴露于Fe²⁺或Fe³⁺在低至中剂量（0.01–10 μg mL^–1）下几乎不诱导•O₂^–，但高剂量（>10 μg mL^–1）导致基线•O₂^–的显著抑制。PQN和异戊二烯SOA单独暴露均诱导显著的•O₂^–产生，但加入Fe后，有机物诱导的•O₂^–随Fe剂量升高而降低，且Fe³⁺的抑制效应强于Fe²⁺。细胞活力实验排除了毒性导致的信号下降。这表明Fe能主动抑制有机诱导的•O₂^–。

**3. 铁介导抑制的机制**
qRT-PCR分析显示，所有暴露组的SOD1表达均无变化，排除SOD1歧化作用。单独Fe不改变TFRC表达，但高剂量Fe³⁺显著下调NOX2。PQN显著上调TFRC和NOX2，异戊二烯SOA也有类似趋势但未达显著，提示有机物可诱导细胞铁缺乏并激活NADPH氧化酶。当PQN与Fe联合暴露时，PQN诱导的TFRC上调被显著削弱（Fe²⁺减少22%，Fe³⁺减少14%），NOX2表达也降至接近基线。Apocynin抑制实验确认，所有处理组的•O₂^–产生几乎完全依赖于NADPH氧化酶活性。综合结果提出机制：有机化合物可通过螯合细胞内不稳定铁池（LIP）造成功能性铁缺乏，进而激活NADPH氧化酶产生•O₂^–；外源性Fe通过补充铁池或与有机物复合，缓解铁缺乏、降低NOX活性；高剂量Fe还通过直接化学淬灭•O₂^–（反应速率常数Fe³⁺高于Fe²⁺）和转录下调NOX2增强抑制效应。

**4. 意义与未来展望**
本研究揭示了Fe在巨噬细胞中抑制有机物诱导的•O₂^–产生，提示PM暴露的净生物效应并非各组分毒性的简单加和，而是由金属-有机物相互作用决定的整合响应。但这一结论仅限于细胞•O₂^–测定，不能直接外推至无细胞氧化电位测定。未来需在真实BWP和大气样本中验证基因表达响应，并研究其他过渡金属（如Cu、Mn）的交互作用。Fe补充可能作为干预手段，但需严格评估剂量，因为过量铁可能引发ferroptosis或抑制NADPH氧化酶依赖性宿主防御，增加感染风险。

**研究结论**
本研究表明，铁在巨噬细胞中是有机物诱导•O₂^–产生的抑制剂而非促进剂。Fe通过恢复铁稳态（补充细胞内不稳定铁池或与有机物复合并缓解铁缺乏）降低NADPH氧化酶活性，并通过直接化学淬灭消耗•O₂^–。这一双重机制解释了BWP和PM_2.5暴露中观察到的非经典剂量-反应关系，也为重新评估富铁颗粒物的健康效应提供了新框架——必须综合考虑金属和有机组分之间的相互作用。