《Bioactive Materials》：3D-printed PCL scaffold coated with chitosan–hyaluronic acid hydrogel loaded with NGF-overexpressing UiPSC-derived neural crest cells restores erectile function via cavernous nerve regeneration
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本研究探讨了在CN损伤大鼠模型中，通过神经周围给予装载在3D打印细胞相容性支架内的过表达神经生长因子（nerve growth factor, NGF）的神经嵴细胞（neural crest cells, NCCs）促进海绵体神经（cavernous nerv
本研究探讨了在CN损伤大鼠模型中，通过神经周围给予装载在3D打印细胞相容性支架内的过表达神经生长因子（nerve growth factor, NGF）的神经嵴细胞（neural crest cells, NCCs）促进海绵体神经（cavernous nerve, CN）再生是否能恢复勃起功能。研究人员从尿液来源干细胞（urine-derived stem cells, USCs）中生成诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），过表达NGF，并将其分化为NCCs。此外，通过挤出式3D打印制备了聚己内酯（polycaprolactone, PCL）支架，并涂覆温敏壳聚糖/透明质酸（hyaluronic acid, HA）/β-甘油磷酸水凝胶。将NGF-NCCs加载到支架上，体外实验验证了高细胞加载、存活和分化潜能。将60只12周龄雄性Sprague-Dawley大鼠分为五组：假手术组（S）；CN损伤组（I）；以及损伤组分别接受单纯PCL涂覆壳聚糖-HA水凝胶（H）、单纯NGF–UiPSC–NCCs（N）或负载NGF–UiPSC–NCCs的PCL涂覆壳聚糖-HA水凝胶（NH）包绕损伤CN。术后4周，H、N和NH组在电刺激时的勃起反应均较I组显著改善，其中NH组恢复最为显著。在CN再生方面，H、N和NH组显示轴突密度增加，神经元再生和髓鞘再生标志物表达上调。此外，这些组显示海绵体凋亡减少，内皮含量和平滑肌/胶原比例得以保持。在所有指标中，NH组表现出最优的治疗效果，其次为N组和H组。研究结果表明，神经周围应用负载NGF–UiPSC–NCCs的3D打印PCL涂覆壳聚糖-HA水凝胶可通过增强CN再生、随后恢复神经传递和抑制海绵体结构改变来恢复勃起功能。
**研究背景与问题**
前列腺癌全球发病率不断上升，根治性前列腺切除术（radical prostatectomy, RP）数量随之增加。术后勃起功能障碍（erectile dysfunction, ED）是常见并发症，发生率高达60%–70%。ED的主要病因是术中损伤海绵体神经（cavernous nerve, CN），继而引起海绵体平滑肌细胞凋亡和进行性纤维化，导致患者对一线药物5型磷酸二酯酶抑制剂（PDE5i）反应不佳。现有阴茎康复手段在临床中的获益尚不明确。因此，促进CN再生被认为是恢复ED的关键策略。此前干细胞疗法多聚焦于海绵体组织再生，极少直接针对损伤CN。神经嵴细胞（neural crest cells, NCCs）是周围神经系统谱系的祖细胞，可分化为外周神经元和施万细胞，是理想的神经再生细胞来源。神经生长因子（nerve growth factor, NGF）能促进轴突生长和施万细胞存活。3D打印聚己内酯（polycaprolactone, PCL）支架涂覆壳聚糖-透明质酸（hyaluronic acid, HA）水凝胶可提供物理支撑和局部缓释微环境。
**研究目的与意义**
研究人员提出假设：通过神经周围给予负载过表达NGF的尿源性干细胞来源诱导多能干细胞（urine-derived stem cells–induced pluripotent stem cells, UiPSCs）分化而来的NCCs（即NGF-UiPSC-NCCs）的3D打印PCL-壳聚糖-HA水凝胶支架，可促进CN再生，从而恢复勃起功能。该研究首次在CN损伤大鼠模型中证实此策略有效，并展示利用自体尿液来源细胞进行临床转化的可行性。
**主要技术方法**
本研究使用60只12周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，随机分为五组：假手术组（S）、CN损伤组（I）、单纯PCL-壳聚糖-HA水凝胶组（H）、单纯NGF-UiPSC-NCCs组（N）以及负载NGF-UiPSC-NCCs的水凝胶支架组（NH）。样本来源包括人尿液样本（用于分离USCs）和上述大鼠。技术方法包括：人USCs分离与iPSC重编程、慢病毒介导NGF过表达、NCC定向分化；挤出式3D打印制备PCL支架并喷涂PCL膜，涂覆温敏壳聚糖/HA/β-甘油磷酸水凝胶；体外细胞负载、活力和NGF分泌检测；术后4周电刺激测定海绵体内压（intracavernous pressure, ICP）和平均动脉压（mean arterial pressure, MAP）；采用Toluidine blue染色、Masson三色染色、TUNEL凋亡检测、免疫荧光、Western blot和ELISA等评估组织学与分子变化。
**研究结果**
**单独或负载于壳聚糖-HA水凝胶的NGF-UiPSC-NCCs神经周围给予对术后4周勃起功能恢复的治疗效果**
通过电刺激检测最大ICP/MAP和AUC/MAP比值，结果显示：I组显著低于S组；H、N、NH组均较I组显著改善，其中NH组恢复最显著。NH组最大ICP/MAP与S组无显著差异，但AUC/MAP仍低于S组，提示勃起维持功能未完全恢复正常。
**实验各组间神经再生效果的比较**
通过Western blot、免疫荧光和Toluidine blue染色检测神经元再生标志物Tuj-1、GAP43、nNOS，髓鞘再生标志物MBP，以及施万细胞活化标志物p75NTR、S100β。结果显示：H、N、NH组Tuj-1表达较I组增加；N和NH组nNOS、GAP43表达增加；NH组p75NTR、S100β表达显著升高；N和NH组MBP表达升高，且NH组髓鞘化轴突密度最高。表明水凝胶和NGF-NCCs可促进CN轴突再生和髓鞘形成。
**单独或负载于水凝胶的NGF-UiPSC-NCCs神经周围给予对海绵体完整性保护的作用**
通过TUNEL染色检测细胞凋亡，免疫荧光检测平滑肌标志Calponin-1和内皮标志PECAM-1，Masson三色染色评估平滑肌/胶原比例。结果：H、N、NH组海绵体凋亡减少，Calponin-1和PECAM-1阳性区域增加，平滑肌/胶原比例升高，其中NH组效果最优。表明CN再生后神经传递的恢复抑制了海绵体的继发性结构改变。
**讨论与结论**
研究人员认为，3D打印PCL-壳聚糖-HA水凝胶支架为细胞提供了稳定的物理支撑和免疫隔离微环境，增强了NGF-UiPSC-NCCs的定植和存活。NGF的持续分泌和NCCs向神经元及施万细胞分化的能力协同促进了CN再生，进而恢复神经传导，抑制海绵体凋亡和纤维化。与单独细胞或单独水凝胶相比，组合治疗在各项指标上均更优。该研究存在一定局限性，如仅在CN挤压模型中评估、仅观察单一时间点、未分析细胞体内分布等。论文发表在《Bioactive Materials》。研究数据表明，神经周围应用负载NGF-UiPSC-NCCs的3D打印PCL涂覆壳聚糖-HA水凝胶可恢复CN损伤大鼠的勃起功能，这一效果可能归因于增强的CN再生、随后神经传递的恢复以及海绵体结构改变的抑制。
